3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

이 프로토콜은 GLUture 조직 접착제를 사용하여 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징 능력을 향상시킵니다. 이를 통해 연구자들은 3령 초파리 유충의 후각 회로 뉴런에서 칼슘 역학을 이해할 수 있습니다. 단순성과 비용 효율성은 이 기술의 두 가지 주요 장점으로, 신경생리학적 연구에서 실험을 더욱 안정적이고 접근 가능하게 만듭니다.

6cm 페트리 접시에 작은 정사각형의 화학 물티슈를 놓아 두 개의 공급 챔버를 준비합니다. 굶주린 상태의 경우 350마이크로리터의 증류수를 추가하십시오. 굶주리지 않은 조건의 경우 350마이크로리터의 0.2몰 자당 용액을 추가합니다.

동일한 수의 세척된 유충을 각 먹이실로 옮깁니다. 유충이 실온에서 2시간 동안 자당, 굶주리지 않은 물 또는 굶주린 증류수를 먹도록 합니다. 24 x 50mm, 1.5mm 두께의 현미경 커버 유리에 주사기에서 분배된 바셀린을 사용하여 우물을 만듭니다. 커버 유리 중앙에 GLUture 국소 조직 접착제를 소량 떨어뜨립니다.

유리 막대를 사용하여 GLUture를 얇고 균일한 층으로 고르게 펴 바릅니다. 브러시나 가는 와이어를 사용하여 한 마리의 유충을 GLUture에 조심스럽게 옮깁니다. 유충의 복부 쪽을 접착제 위에 부드럽게 누릅니다.

GLUture를 건조시켜 유충이 완전히 고정되도록 합니다. 유충이 고정되면 유충을 100마이크로리터의 이미징 완충액에 담급니다. 커버 유리를 Yokogawa CSU-W1 스피닝 디스크 컨포칼 스캐너 모듈과 칼슘 이미징용 CCD 카메라에 연결된 Leica DMi8 도립 현미경에 놓습니다.

3.2 - 3.3단계에 설명된 대로 칼슘 이미징을 위해 GLUture가 있는 현미경 커버 유리를 준비합니다. Ishimoto 및 Sano, 2018에 의해 설명된 해부를 완료합니다. P-10 마이크로 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 5마이크로리터의 해부 용액으로 해부된 뇌를 조심스럽게 흡인합니다.

뇌를 천천히 GLUture로 배출합니다. GLUture가 마르기 전에 두 개의 뇌엽이 아래를 향하고 등쪽 복측 탯줄이 위를 향하도록 뇌를 등쪽이 위로 향하게 합니다. P-200 마이크로 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 칼슘 이미징 완충액을 커버 유리의 고정된 유충 뇌 위로 옮깁니다.

Leica DMi8 도망이 현미경을 사용하여 칼슘 이미징을 위해 VisiView를 엽니다. 필터가 있는 10X/1.4 모든 대물렌즈를 사용하여 GFP 레이저와 RFP 레이저 사이를 전환하여 이미지를 캡처합니다. 노출 값의 범위는 100밀리초에서 1000밀리초이며 게인은 해당 노출 값의 50%로 설정됩니다.

이미지 캡처 중에 2의 입찰 계수가 적용됩니다. RFP 레이저로 tdTomato 신호를 검색하여 관심 있는 뉴런을 식별합니다. 관심 영역이 식별되면 GFP 레이저로 전환하여 GCaMP6f 신호를 캡처합니다.

두 채널의 스택 이미지를 캡처하기 전에 tdTomato 및 GCaMP 신호가 모두 구어체인지 확인하십시오. tdTomato 및 GCaMP6f 성공 신호의 두 개의 개별 시계열 기록을 초당 0.5프레임의 속도로 동시에 총 2분 동안 캡처합니다. tdTomato 및 GCaMP6f 신호 스택을 ImageJ로 가져옵니다.

올바른 관심 영역을 식별하려면 tdTomato 및 GCaMP6f 신호를 병합하여 공동 국소화를 확인합니다. 확인 후 tdTomato 및 GCaMP6f 채널을 분할합니다. 사용자 지정 ROI 기반 매크로를 ImageJ로 가져옵니다.

GCaMP6f 스택을 선택하고 칼슘 분석을 위해 실행을 누르십시오. 매크로는 먼저 최대 강도 투영을 생성하고, 스택 레그 플러그인을 사용하여 모션 보정을 수행하고, 표백제 보정을 적용합니다. 동작 보정은 각 프레임의 뇌엽과 같은 광범위한 직사각형 관심 영역을 정의하여 수행되었습니다.

직사각형 상자는 모든 프레임에서 지역적, 공간적 및 ROI 모양을 유지하면서 정확한 모션 보정을 보장하기 위해 모든 프레임에서 전체 ROI를 덮어야 합니다. 각 ROI, 매크로 계산 1, 모든 프레임의 강도, 2, 처음 10 프레임 동안의 최대 강도 값과 최소 강도 값의 차이와 같은 기준선 변동 차이, 3, 최대 프레임 간 강도 변화, 델타 F. 10 단위 미만의 강도 변동을 나타내는 ROI가 제거되었습니다. 최종 데이터 세트는 4개의 열, 1개의 시간 및 프레임, 2개의 표본 조건 굶주림 또는 먹이, 3개의 복제본 ID, 개별 표본 및 4개의 정규화된 강도로 구성되었습니다.

F norm 값은 0에서 1로 조정됩니다. 마지막으로 사용자 정의 R 스크립트를 사용하여 R에서 데이터 분석 및 시각화를 수행했습니다. 분석을 실행하기 전에 ggplot2, dplyr 및 readr를 포함한 필수 패키지가 설치 및 업데이트되었습니다.

출력에는 시계열 기록에서 처음 30프레임, 60프레임 및 모든 프레임에 대한 정규화된 칼슘 강도를 보여주는 히트 맵과 정규화된 강도의 중앙값을 보여주는 상자 그림이 포함되었습니다. 정규화된 칼슘 강도의 중요성은 Mann-Whitney U 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 그림 1은 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징 설정에 대한 개략도입니다.

전체 유충 샘플 A 또는 유충 뇌 샘플 B를 단색의 얇은 GLUture 층에 고정하고 바셀린 우물 안에 펴고 현미경 커버 유리 위에 둥글게 했습니다. 샘플을 칼슘 이미징 완충액인 연한 파란색에 담그고 거꾸로 된 회전 디스크 공초점 현미경에서 이미징을 위해 배치했습니다. 샘플의 칼슘 형광 이미지의 시계열이 캡처되었습니다.

회로도는 BioRender를 사용하여 준비되었습니다. 그림 2는 GCaMP6f 형광 이미징을 보여줍니다. A, 488나노미터 채널, GCaMP6f 및 녹색, 525나노미터 채널, tdTomato에서 형광을 보여주는 분할 이미지, 빨간색.

병합된 이미지가 오른쪽 패널에 표시됩니다. B, 키스톤 LN에서 녹색의 GCaMP6f와 빨간색의 tdTomato에 대한 시간 경과에 따른 원시 형광 추적의 예. GCaMP6f 형광의 변동은 칼슘 활성을 나타내는 반면 안정적인 tdTomato 신호는 키스톤 LN을 식별하기 위한 대조군으로 사용됩니다.

C, 생체 내 상단 패널 및 생체 외 하단 패널 준비를 위한 대표적인 GCaMP6f 신호 이미지. 기아가 없는 샘플은 왼쪽에 표시되고 기아된 샘플은 오른쪽에 표시됩니다. 그림 3은 GCaMP6f 형광 측정을 보여줍니다.

A, 왼쪽 상단 패널은 생체 내 준비 전체 유충에서 굶주리지 않은 N=5 및 굶주린 유충 N=5의 핵심 요소로부터의 칼슘 신호의 평균 시간적 역학을 보여주는 히트 맵을 보여줍니다. 오른쪽 상단 패널의 상자 그림은 생체 내 제제에서 회색의 굶주림과 흰색의 굶주림 샘플 사이의 정규화된 칼슘 신호 강도를 비교합니다. Mann-Whitney U 테스트, P는 0.001 미만입니다.

B, 왼쪽 하단 패널은 생체 외 준비 해부 뇌에서 굶주리지 않은 N=5 및 굶주린 N=5로부터 Keystone LN으로부터의 칼슘 신호의 평균에서 문맥 역학에 대한 해석을 보여주는 히트 맵을 보여줍니다. 오른쪽 하단 패널의 상자 그림은 생체 외 준비에서 굶주리지 않은 회색 샘플과 굶주린 흰색 샘플 간의 정규화된 칼슘 신호 강도를 비교합니다. Mann-Whitney U 검정 B는 0.001 미만입니다.

유충 칼슘 이미징 접근법을 입증하기 위해 우리는 이를 초파리 유충의 생체 내 및 생체 외 제제 모두에 성공적으로 적용했습니다. 두 준비 모두에서 우리는 기아가 없는 샘플에 비해 더 높은 키스톤 LN 활성과 기아 샘플을 관찰했습니다. 이러한 더 높은 키스톤 활동은 60초 동안 응답의 시간적 표현을 보여주는 히트 맵과 평균 신호 강도 값을 묘사하는 상자 그림에서 명확하게 관찰되었습니다.

이러한 결과는 굶주린 동물에서 더 높은 후각 뉴런 활동을 입증한 최근 연구와 일치합니다. 이 비디오에서 시연된 바와 같이, GLUture 조직 접착제는 생체 내 및 생체 외 설정 모두에서 모션 아티팩트를 크게 줄입니다. 이 방법은 냄새의 외부 적용 및 신경 조절제의 내부 중융합과 같은 다양한 종류의 자극을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.