MALDI 접근법 을 통한 박테리아 단백질체학 프로파일링을 이용한 낙농장의 미생물 안전성 평가
2025년 10월 7일
이 프로토콜은 배양체학과 MALDI-TOF MS를 결합하여 유제품의 미생물 구성을 신속하고 비용 효율적으로 평가할 수 있습니다. 기존 배양 방법보다 짧은 처리 시간으로 16S rRNA 시퀀싱에 필적하는 분류 결과를 제공합니다.
우리는 우유, 크림, 버터, 치즈 등 다양한 일상 제품에서 미생물 군집을 준비하고 분리하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 미생물이 분리되면 MALDI-TOF MS(말디-토프 MS)를 이용해 신속하고 정확하게 식별할 수 있습니다. 배양 조건 최적화는 여전히 핵심 과제이며, 데이터베이스 공백과 그람 양성 및 포자 형성 박테리아의 까다로운 추출도 함께 있습니다. 우선, 대표적인 유제품 샘플을 확보하여 균일성을 위해 충분히 섞으세요.
무균 방식으로 1밀리리터 또는 1그램의 고체 샘플을 15밀리리터 원뿔형 원심분리관에 9밀리리터의 무균 액체 배지를 넣어 옮깁니다. 샘플을 균질화하기 위해 튜브를 30초에서 60초 동안 격렬하게 소용돌이 돌립니다. 다음으로, 균질화된 현탁액 1밀리리터를 연속된 튜브에 10배 희석하여 각각 9밀리리터의 멸균 용액을 담아 준비합니다.
각 희석액을 소용돌이 또는 흔들어 완전히 섞으세요. 그 후 원본 샘플 또는 조제 희석액 중 0.1밀리리터를 추출하여 적절한 한천 배지를 포함한 준비된 페트리 접시 표면에 옮깁니다. 멸균 스프레더를 사용해 한천 판 표면에 균열을 고르게 뿌립니다.
호기성 배양을 위해서는 준비된 샘플과 함께 APT, M17, CBL, MPCA, TSA 한천 플레이트를 접종하세요. 플레이트를 37도, 30도의 호기성 조건에서 24시간 배양하세요. 혐기성 배양을 위해서는 접종된 MRS 한천 플레이트를 혐기성 챔버에 넣고 섭씨 37도와 30도에서 24시간에서 72시간 동안 배양합니다.
인큐베이터에서 플레이트를 분리하여 매일 검사하여 미생물 성장을 모니터링하세요. 1마이크로리터 미생물 루프를 사용해 선택된 군락들을 같은 한천 배지에 줄로 표시하여 아방배양합니다. 이전에 사용한 것과 같은 조건에서 배양하세요.
질량분석법 분석의 경우, 먼저 MALDI 매트릭스 용액을 준비하는 것부터 시작하세요. 용매 혼합물은 50% 아세토니트릴, 47.5% HPLC 등급 물, 2.5% 트리클로로아세트산 사용으로 준비합니다. 기질 화합물을 용매 혼합물에 약 10밀리그램/밀리리터 농도로 용해합니다.
직접 콜로니 전송 방법을 이용한 MS 박테리아 식별을 위해서는 멸균 루프를 사용해 배양된 박테리아 콜로니 1마이크로리터를 MALDI 표적 플레이트의 한 지점에 옮깁니다. 박테리아 물질을 펴서 플레이트 위에 얇고 고르게 덮는 층을 만듭니다. 건조 후에는 HCCA 매트릭스 용액 1마이크로리터를 위에 넣고 실온에서 자연 건조시킵니다.
목표 지점 포름산 추출법에서는 일회용 미생물 루프나 멸균 이쑤시개를 사용해 단일 군락에서 소량의 박테리아 생체량을 채취합니다. 재료를 MALDI 타겟판의 한 지점에 직접 발라서 얇고 고르게 만든 층을 만듭니다. 번진 부위에 70% 개미산 용액 1마이크로리터를 넣으세요.
얼룩이 마르면 1마이크로리터의 HCCA 매트릭스 용액을 덮고 실온에서 자연 건조시킵니다. 튜브 내 단백질 추출법에서는 한천 배양판에서 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 300마이크로리터 멸균수를 담은 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관으로 완전한 콜로니를 옮깁니다. 최종 에탄올 농도는 약 75%로 900마이크로리터 첨가됩니다. 잠시 혼합한 후 실온에서 15,000g에서 튜브를 2분간 원심분리합니다.
그 후에는 세포 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 상청액을 버리세요. 그 다음 건조 세포 펠릿에 70% 개상산 20에서 50마이크로리터를 첨가합니다. 피펫팅이나 소용돌이 처리로 내용을 혼합하여 펠릿이 완전히 재현탁될 때까지 조절하세요.
이제 개미산 현탁액에 같은 양의 아세토니트릴을 넣고 충분히 섞어주세요. 튜브를 15,000g에서 2분간 원심분리합니다. 생성된 상원액 1마이크로리터를 MALDI 표적 판의 지정된 지점에 옮기고 건조시킵니다.
그 후 말린 부위에 1마이크로리터의 HCCA 매트릭스 용액을 덮습니다. 대장균 DH5 알파 추출물이 포함된 박테리아 테스트 표준 또는 E.coli ATCC 25922 단백질 추출물, 리보뉴클레아제, 마이오글로빈이 포함된 미생물학 교정기 중 1마이크로리터를 피펫으로 채취합니다. 스펙트럼 획득과 미생물 식별을 위해 MALDI 표적 판에 보정 스팟을 준비하세요.
준비된 샘플 스팟과 캘리브런트 스팟을 MALDI 타겟 플레이트에 질량분석기에 적재합니다. 보정 분석은 보정 모드에서 실행하여 시스템을 보정합니다. 일반 스펙트럼 획득을 위해 질량분석기를 선형 양성 이온 모드로 작동시킵니다.
그 다음, 질량분석기의 질량 검출 범위를 2,000에서 20,000 질량 대 전하 비율로 설정하세요. 각 지점마다 스펙트럼을 복제하여 샘플당 최소 네 개의 기술적 복제를 생성하세요. 이제 Savitzky-Golay 방법을 평활화 알고리즘으로 적용해 보겠습니다.
배경 잡음을 제거하기 위해 TopHat 알고리즘을 사용해 기준선 보정을 하세요. 그 다음 중심체 모드를 사용해 피크를 감지합니다. 미확인 박테리아 분리균의 처리된 질량 스펙트럼을 MALDI 소프트웨어 내 미생물 식별 플랫폼에 업로드하고 동일시 실행합니다.
식별 점수는 제조사의 기준에 따라 평가하세요. 질량분석법 스펙트럼은 종별 단백질 프로필을 나타내어 속 또는 종 수준에서 식별할 수 있게 했습니다. 수목도는 같은 종의 균주 간 높은 유사성과 종 간 명확한 구분을 보여주었다.
Bacillus licheniformis의 잠복 기간이 짧아 12시간으로 2.38의 높은 ID 점수를 얻었고, 18시간에서 24시간의 긴 잠복 기간은 포자 신호의 우세로 인해 ID 점수 값이 1.85로 낮아졌습니다. 샘플 준비 방법 중에서는 튜브 내 단백질 추출이 2.23의 최고 ID 점수를 기록했고, 그 다음으로 표적 내 개성 추출이 1.97, 직접 콜로니 이식이 1.61의 최저 점수를 기록했습니다. 컬추로믹스와 맞춤형 샘플 준비를 결합함으로써 MALDI는 더 정밀하고 빠른 마이크로바이옴 분석을 낮은 비용으로 가능하게 하여 참조 16S rRNA 방법과 유사한 결과를 제공합니다.
이 프로토콜은 유제품 내 미생물의 일상적이고 고처리량 모니터링을 가능하게 하여 검출 속도와 정확성을 향상시키고, 궁극적으로 식품 품질 및 안전 시스템을 강화합니다. MALDI 데이터베이스 확장과 산업 실험실 워크플로우 자동화는 미생물 식별을 향상시키고, 처리량을 높이며, 오류를 줄이고, 미생물군 모니터링을 가속화할 것입니다.
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개요
이 연구는 배양학 및 MALDI-TOF MS 조합을 활용한 유제품의 미생물 조성 신속 평가 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 16S rRNA 시퀀싱과 비슷한 분류학적 결과를 제공하면서도 기존 배양 기술보다 빠른 결과를 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 미생물 조성 평가
- 유제품 미생물학
- 생물학에서의 질량 분석법 응용
배경
- 식품 안전에서의 미생물 식별 중요성
- 유제품에서의 종 배양 및 식별과 관련된 도전
- 미생물학에서의 MALDI-TOF MS 사용
사용된 방법
- 유제품으로부터의 미생물 군집 분리 및 준비
- 박테리아 식별을 위한 MALDI-TOF MS
- 연속 희석 및 배양을 포함한 실험적 접근법
주요 결과
- 높은 특이성으로 박테리아를 성공적으로 식별
- 배양 시간의 비교 및 식별 점수에 미치는 영향
- 단백질 추출을 위한 효과적인 프로토콜 시연
결론
- 이 연구는 유제품의 미생물 식별을 위한 신속한 방법을 보여줍니다.
- 이 접근법은 식품 안전 및 미생물학 연구에 중요한 의미를 가집니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid, high-throughput microbial profiling of dairy products using MALDI-TOF MS enables food safety labs to detect and identify contaminants with greater speed and accuracy. This proteomic approach supports critical quality control inflection points, reducing risk of undetected microbial hazards in manufacturing. The method's robust, reproducible outputs strengthen enterprise-wide food safety and compliance strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microbial presence and diversity in complex dairy matrices.
- Supports functional validation of microbial safety targets through species-level identification.
- Facilitates predictive confidence in contamination risk assessment and mitigation strategies.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible workflows for microbial detection across diverse dairy products.
- Generates quantitative protein fingerprint spectra for robust assay development and benchmarking.
- Enables scalable, high-throughput screening compatible with routine quality control operations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by providing rapid, species-level microbial identification.
- Ensures continuity from discovery of contaminants to preclinical validation of food safety interventions.
- Reduces mechanistic ambiguity in microbial risk assessment for food product pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This MALDI-TOF MS protocol integrates from early microbial discovery through routine screening and translational safety validation in food industry pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microbial contamination and clarifies species-specific risks.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay readiness and cross-lab standardization.
- Analytics: Delivers high-resolution protein spectra and identification scores for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical safety validation by enabling rapid, actionable microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable platform for ongoing microbial safety monitoring across product lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbial safety and reduces undetected contamination risk.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for product release and strengthens compliance with safety standards.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of quality control interventions and resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and microbial culturomics for optimal execution.
- Demands access to MALDI-TOF MS instrumentation and robust spectral databases.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data interpretation protocols.
- Must adapt extraction and incubation parameters for different microbial and dairy matrices.
- Database gaps and challenging extraction of certain bacteria may limit identification in some cases.
