단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

우리는 단일 세포 질량 분석 연구를 위해 세포 대사 산물의 무결성을 보존하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 세척, 담금질 및 보관 조건이 세포 대사 산물에 어떤 영향을 미치는지 조사했습니다. 세포 이질성과 질병 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 단일 세포 대사체학 연구를 발전시키기 위해 새로운 시료 전처리 방법과 질량 분석 기술이 최근 개발되었습니다.

연구자들은 제한된 시료 양, 시료 복잡성으로 인한 검출 감도 감소, 시료 준비 및 분석으로 인한 대사 산물 변화 등 여러 가지 주요 과제를 극복해야 합니다. 우리는 단일 세포 질량 분석법 대사체 연구를 위해 세포 대사 산물과 세포 무결성을 보존할 수 있는 포괄적인 시료 전처리 기술을 시연합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 질량 분석 기술을 사용하여 단일 세포 대사체 연구를 위한 샘플의 준비, 저장 및 운송을 위한 간단하고 효과적인 방법을 제공할 수 있습니다.

시작하려면 5% 이산화탄소가 함유된 가습 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 매일 세포의 융합성을 모니터링하고 배양이 80% 융합성에 도달하면 계대합니다. 계대를 위해 접시에서 배지를 흡인하고 PBS 5밀리리터로 한 번 헹굽니다.

세포 분리를 용이하게 하기 위해 섭씨 37도에서 2밀리리터의 0.25% 트립신 EDTA와 함께 세포를 3분 동안 배양합니다. 8밀리리터의 예열 완전 배지를 첨가하여 트립신을 중화하고 부드럽게 피펫을 사용하여 세포를 분산시킵니다. 현탁액 1밀리리터를 세포 계수를 위해 신선하고 완전한 배지 9밀리리터에 옮깁니다.

세포를 파종하려면 밀리리터당 10의 1 곱 10의 최종 농도로 세포를 희석하십시오. 개별 18mm 유리 커버 슬립을 12웰 플레이트의 웰에 넣습니다. 2밀리리터의 완전 배지와 200마이크로리터의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하여 웰당 5개의 세포의 거듭제곱으로 10의 2배를 달성합니다.

부착을 허용하기 위해 세포를 밤새 배양합니다. 세포를 세척하기 위해 12웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 차가운 포름산암모늄 용액을 추가합니다. 그런 다음 멸균 겸자를 사용하여 부착 세포가 포함된 각 커버 슬립을 웰에서 부드럽게 들어 올리고 2밀리리터의 차가운 0.9% 포름산암모늄 용액으로 미리 채워진 별도의 웰에 2-3초 동안 잠시 넣습니다.

각 포름산암모늄을 헹구고 세포가 위를 향하도록 커버 슬립을 알루미늄 호일 용기 안의 페트리 접시에 넣습니다. 커버 슬립 위에 10-20밀리리터의 액체 질소를 천천히 부어 완전히 덮을 수 있도록 합니다. 그리고 즉시 핀셋으로 페트리 접시를 기울여 남아 있는 액체 질소를 디캔팅합니다.

극저온 장갑과 절연 핀셋을 사용하여 액체 질소 냉각 커버 슬립이 들어 있는 페트리 접시를 진공 농축기 챔버에 넣습니다. 눈에 보이는 액체 질소가 증발하고 커버 슬립이 건조해 보일 때까지 5-7분 동안 표준 진공 설정을 사용하여 샘플을 처리합니다. 건조된 커버 슬립에 잔류 액체 질소나 얼음 결정이 포함되어 있지 않은지 확인하십시오.

그런 다음 용기를 종이 타월로 싸서 섭씨 80도의 냉동실에 48시간 동안 옮깁니다. 보관 후 페트리 접시가 들어 있는 뚜껑 전표를 실온 건조기에 10분 동안 옮깁니다. 커버 슬립을 데시케이터에서 제거하기 전에 커버 슬립의 응결된 서리나 물이 완전히 사라졌는지 확인하십시오.

샘플을 두 그룹으로 나누고 적절하게 처리하십시오. 이제 단일 프로브를 XYZ 스테이지에 장착하고 디지털 현미경 아래에 위치한 전동 XYZ 매니퓰레이터에 부착합니다. SCMS 분석을 위해 단일 프로브 설정을 질량 분석기에 결합합니다.

추출 용매로 순도 99.9% 이상인 0.1% 포름산을 함유한 아세톤 니트릴을 사용하고 주사기 펌프를 사용하여 분당 150나노리터의 유속으로 전달합니다. 양이온 및 음이온 모드에 대한 질량 분석 매개변수를 설정합니다. 이제 그룹 1과 그룹 2의 두 커버 슬립을 단일 프로브 SCMS 설정의 전동 XYZ 스테이지에 함께 놓고 현미경을 사용하여 분석할 세포를 무작위로 선택합니다.

질량 스펙트럼을 획득한 후 동일한 단일 프로브, 용매 유속 및 이온화 전압을 사용하여 그룹당 약 30개의 세포를 분석합니다. 사용자 정의 R 스크립트를 사용하여 원시 SCMS 데이터를 사전 처리하고 배경 및 노이즈 제거를 적용한 다음 총 이온 전류에 이온 강도 정규화를 적용합니다. Python 패키지 MSD 동위원소를 사용하여 SCMS 데이터를 탈동위원소합니다.

피크 정렬 수행 사내 Python 스크립트를 사용합니다. 비닝을 위해 0.01 마스터 전하 비율의 빈 너비를 적용하고 피크 정렬을 위해 0.01 마스터 전하 비율 또는 5ppm의 질량 허용 오차를 적용합니다. Metabo Analyst 6.0을 사용하여 통계 데이터 분석을 수행합니다.

T-테스트를 수행하고 상대적인 대사 산물 수준을 보여주는 히트 맵을 생성합니다. 상위 100개 및 T-검정 또는 Inova를 사용하여 유의성에 따라 순위가 매겨진 상위 100개 대사산물을 생성하고 유의한 차이가 있는 상위 100개 대사산물을 사용하여 히트 맵을 표시합니다. 마지막으로, 데이터베이스 검색을 위해 10ppm의 질량 허용 오차를 사용하여 인간 대사체 데이터베이스에 대해 정확한 마스터 전하 값을 검색합니다.

양이온 모드의 주성분 분석은 그룹 1과 그룹 2가 밀접하게 겹치는 것으로 나타났으며, 이는 매우 유사한 대사 산물 프로필을 나타냅니다. 음이온 모드에서는 비슷한 패턴이 관찰되었지만 그룹 2는 약간 더 뚜렷하게 나타났습니다. 상위 100개 대사산물에 대한 히트 맵 분석은 두 이온 모드 모두에서 그룹 1과 그룹 2 사이에 매우 일관된 풍부도 패턴을 보여주었습니다.

주요 변화 또는 그룹별 클러스터링은 관찰되지 않습니다. 일부 대사 산물 클러스터의 사소한 변화는 이온화 효율 또는 대사 산물 안정성의 차이를 반영할 수 있습니다.