마우스의 기침 및 재채기 반사의 정밀 유도 및 구별

이 프로토콜은 쥐의 호흡 반사에 초점을 맞춥니다. 기관과 비강을 자극하여 기침과 재채기를 유도하는 것을 목표로 하며, 청각 특징에 따라 이 두 가지 유형의 사건을 구분할 것입니다. 이전 연구들은 마우스의 호흡 검사와 기침, 재채기 행동을 자극하기 위해 네뷸화된 캡사이신이나 구연산을 자주 사용했습니다.

그러나 네밙뜸화에 의한 호흡 검사 자극이 기침, 재채기, 혹은 둘 다를 유발하는지는 아직 명확하지 않으며, 이 두 반응을 구분할 신뢰할 만한 방법이 아직 없습니다. 이 프로젝트를 위해 기관이나 비강을 선택적으로 자극하여 기침과 재채기를 유도하는 방법을 확립했습니다. 또한 기침과 재채기의 구별되는 특징을 확인하기 위해 음향 분석을 사용했습니다.

우리의 대규모 연구는 기침 및 재채기 장애에 대한 미래 약물 개발을 직접적으로 지원하는 강력한 도구를 제공합니다. 먼저, 28게이지 바늘을 길이 약 5밀리미터의 캐뉼라에 자르세요. 겸자와 연마지로 양쪽 끝을 매끄럽게 펴고, 한쪽 끝을 실리콘 튜브에 붙입니다.

튜브에 연결된 캐뉼라를 1밀리리터 주사기에 연결하고, 캐뉼라를 물로 세척하여 개성 여부를 확인하세요. 다음으로, 캐뉼라를 2-3 팔 비율로 90도 각도로 구부립니다. 긴 팔을 5cm 길이의 실리콘 튜브에 삽입하세요.

쥐를 무작위로 세 그룹에 나누고, 각 그룹에 6마리씩 배치합니다. 이제 마취된 쥐를 테이블 위에 누운 상태로 고정하세요. 두개골과 경추 털을 면도한 후에는 요오도포르와 알코올로 해당 부위를 소독하세요.

현미경으로 경추 피부를 약 1센티미터 절개한 후 조직과 근육을 무딘 상태로 해부하여 기관을 노출시킵니다. 32게이지 바늘로 감상연골과 기관 연골 사이의 연조직을 찔러 넣습니다. 그 후 안과 가위로 최소한의 기관 개구부를 만듭니다.

실리콘 덮개로 덮인 금속 캐뉼라를 약 1밀리미터 정도 기관내강에 삽입하고, 캐뉼라-기관 접합부를 7-0 봉합사로 고정합니다. 이제 두피를 약 1cm 절개하고, 목에서 두개골까지 피하로 둔하게 터널을 파세요. 실리콘 튜브를 피하 터널을 통해 두개골까지 연결하고, 치과 시멘트로 두개골에 고정한 후 피부를 꿰매세요.

경추 절개 부위를 봉합하고 동물이 5일간 회복할 시간을 두세요. 초음파 프로브에 포트 호환 밀봉 링을 장착하고, 프로브를 전신 플레티스마그래피 챔버 포트에 삽입하여 기밀 접촉을 보장합니다. 전신 플레티스마그래피 챔버를 유량 센서와 바이어스 유동 시스템에 연결합니다.

두개골 고정 실리콘 튜브를 30cm 연장관에 연결하고, 마우스를 전신 플레티스모그래피 챔버에 넣습니다. 튜브를 챔버 상단 포트를 통해 연장하고, 튜빙 주변에 모델링 클레이로 포트를 밀봉하세요. 호흡 파형 피크가 4 ± 2 이내에 있는지 확인하여 기밀성을 확인하세요.

캡사이신 용액 5밀리리터가 담긴 1밀리리터 주사기를 연장관에 연결하고, 마이크로인젝션 펌프에 장착하세요. 고속 카메라를 챔버를 향해 설치하세요. 카메라 거리와 초점을 조정해 선명한 시야를 확보하고, 샘플링 속도를 초당 160프레임으로 설정하세요.

이제 동시에 전신 용수탐사, 초음파, 카메라 소프트웨어를 시작하세요. 펌프를 작동시켜 캡사이신 주입을 시작하고, 10분간 기침 횟수를 기록하세요. 동물과 시술에 필요한 모든 재료를 준비하세요.

마취 후 마우스를 준비한 후 입체 프레임에 고정하세요. 수술 부위를 요오도포르와 알코올로 소독하세요. 두개골과 비강뼈 위의 피부를 절개하고, 메스로 비강뼈를 노출시킵니다.

마이크로드릴을 사용해 비강뼈와 비중격 연골의 측면 돌기가 만나는 지점에 0.5밀리미터 구멍을 만듭니다. 이제 버 홀을 통해 코 점막을 드러내세요. 32게이지 바늘로 코 점막을 부드럽게 들어 올려 코강을 노출시킵니다.

그 다음 폴리에틸렌 튜브를 입체주체 팔에 장착합니다. 튜브 끝을 버 홀 입구와 평평하게 맞추고, 치과용 시멘트로 튜브를 코뼈에 고정한 후 피부를 꿰매세요. 쥐를 온열 패드 위에 올려놓고 의식이 돌아올 때까지 회복시키세요.

전신 플레티스마그래피 챔버를 제조사 매뉴얼에 따라 유량 센서와 바이어스 유량 시스템에 연결하세요. 다음으로, 초음파 프로브에 포트 어댑터 개스킷을 장착하세요. 프로브를 플레티스모그래피 챔버에 삽입하고 밀폐 상태를 확인하세요.

마우스를 플레티스모그래피 챔버로 옮기고, 폴리에틸렌 튜브를 상단 포트를 통해 연장합니다. 튜빙을 고정하기 위해 모델링 클레이로 포트를 밀봉하세요. 챔버 기밀도를 확인하고 앞서 보여준 대로 카메라를 설치하세요.

마지막으로, 0.25밀리미터 직경의 나일론 필라멘트를 부드러운 관을 통해 코강 안으로 0에서 3밀리미터 깊이까지 밀어 넣습니다. 필라멘트는 핸드헬드 튜브 너머로 5센티미터 정도 노출시키세요. 각 자극 시, 필라멘트의 자유 끝을 약 45도까지 휘게 하여 약 0.6g의 힘을 1초간 코 점막에 전달합니다.

재채기 반응을 기록하면서 30초마다 한 번 자극을 반복하세요. 기계적 비강 자극과 캡사이신 기관절 자극을 받은 기관 또는 비강 수술을 받은 쥐는 각각 재채기와 기침 사건을 유의미하게 증가시켰습니다. 전신 플레티스모그래피 기록에서는 캡사이신 유발 기침과 기계적으로 유도된 재채기에서 단일 및 이중 피크 호흡 흔적이 모두 나타났다.

음향 오실로그램 분석 결과, 기침 음향은 시작에 갑작스럽게 피크 강도가 나타나며, 0에서 30킬로헤르츠 범위에 집중되어 있음을 보여주었습니다. 반면 재채기 오디오는 점진적으로 강도가 높아지고, 0에서 80킬로헤르츠 범위에 걸쳐 있으며, 지속 시간이 더 길었습니다. 단일 피크 기침의 압축 단계는 평균 약 32.39밀리초로, 더블 피크 기침보다 약 53.17밀리초로 훨씬 짧았습니다.

단일 피크 재채기의 평균 압축 단계는 약 44.03밀리초였고, 더블 피크 재채기는 평균 약 74.24밀리초이며 훨씬 더 길었습니다. 단일 피크 패턴은 기침의 77.55%에서 발생했으며, 재채기에서는 32.42%만이 단일 피크를 보였고, 더블 피크 패턴이 67.58%로 우세했습니다. 재채기 청각 지속 시간은 기침 지속 시간보다 유의미하게 길었으나 범위는 겹칩니다. 비강 감각 구심성 절단은 캡사이신에 의한 재채기를 유의미하게 감소시켰으며, 기침은 영향을 받지 않았습니다.