Name: 굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 액틴 공동 침강 분석법을 사용하여 F-액틴에 결합하는 단백질을 분석하는 방법을 익히세요. 이 체외 분석 기법은 세포골격 역학과 단백질 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

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HaCAT 세포에서 굴지의 영화 UCSF에서 위트먼 연구실에서 박사 Praveen 쿠마에 감사합니다.

1. 굴지의 준비 이 분석에 사용되는 굴지의 소스는 10 MG / ML은 -70 º C의 냉동고에 보관 Cytoskeleton 주식 회사 주식 aliquots에서 얻은 비 근육 인간의 혈소판 (β - 굴지)되었습니다. 분석은 굴지는 0.4 4 º C. 10 분 대한 20,000g에 centrifuged 5 MM 트리스 산도 8, 0.2 MM CaCl 2, 0.2 MM ATP와 0.5 MM의 DTT를 포함하는 버퍼에 MG / ML로 희석합니다 monomeric 굴지 있습니다 뜨는은 polymerized 될 준비가 된 것입니다. 굴지의 중합은 또한 50 MM KCl, 1 ㎜ ATP 2 MM MgCl 2 유도합니다. 중합은 1 시간 동안 실온에서 발생합니다. 2. 단백질의 준비 이 분석에서, 우리는 GST - 태그 단백질로 정화되어 talin의 C - 말단를 사용하고 있습니다. 분석에 사용되는 단백질은 F - 굴지와 사전 부화로 집계 사전을 취소 고속 원심 분리를 받게됩니다. 단백질 22 º C. 20 분 대한 베크맨 초원 심 분리기에 10만g에 늘인입니다 3. 굴지 - 단백질 인큐베이션 분석에 굴지 및 단백질의 양은 달라집니다. 이 예제에서 우리는 초과 굴지를 사용하고 있습니다. 일반적으로 어금니 비율은 예를 들어, 계산됩니다. 단백질에 굴지의 4시 1분 어금니 비율. 다음과 같은 분석에서 최종 반응 량은 150 μl입니다. 단백질과 F - 굴지이 incubated하는 버퍼 테스트하기 위해 단백질과 요구 조건에 따라 달라집니다. 이 예제에서, 우리는 10 MM 트리스 산도 7.0, 1 ㎜ ATP, 0.2 MM DTT, 1 MM EGTA, 0.1 MM CaCl 2, MgCl 2 MM 2 포함하는 버퍼를 사용합니다. 단백질과 F - 굴지는 실온에서 1 시간 동안 버퍼에 incubated 수 있습니다. 4. F - 굴지의 침강 부화 후, 샘플 22 º C.에 10만g에 늘인 아르 우리는 비디오 베크맨 초원 심 분리기를 사용합니다. 로터는 신중하게 알약을 방해하지 않는 정도로 제거됩니다. 5. F - 굴지와 단백질 공동 침강 분석 supernatants은 신중 eppendorf 튜브 5 X Laemmli SDS - PAGE 샘플 버퍼로 pipetting하여 제거하는 것은 추가됩니다. 1 X Laemmli SDS - PAGE 샘플 버퍼의 적절한 볼륨, 남은 알약에 추가 최대 pipetted 아래, 새로운 eppendorf 튜브로 전송됩니다. 알약과 supernatants에서 단백질의 상대적인 양의 SDS - PAGE와 젤 또는 모래 바닥 서양의 쿠매시 블루 얼룩하여 분리 따라 분석하고 있습니다. , 굴지와 단백질 상호 작용의 특이성을 결정하기 위해 굴지 공동 sedimentations 농도 - 의존을 수행할 수 있습니다. 에 대한 실험, 단백질의 고정 금액과 굴지의 증가 금액 일련의 이런 종류는 incubated 있으며, 위에 설명된대로 분석 수행됩니다.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

굴지 공동 침전은 F - 굴지에 바인딩 specfic 단백질을 분석하는 시험 관내 분석 간단합니다. 이 비디오에서 우리는 간단한 굴지이 공동 침전을 실시 할 수있는 방법 중 하나를 예를 보여줍니다. 우리는 F - 굴지를 준비하는 방법을 보여줍니다, 테스트하는 단백질과 굴지의 절차 공동 침전을 준비합니다. 굴지 공동 침강 assays을 수행하면 포인트의 수를 고려되어야합니다. 예를 들어, 부화에 대한 버퍼 구성 요소가 테스트하고 산도, 온도 및 소금 농도가 F - 굴지에 바인딩을 영향을 미칠 수있는 단백질에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 F - 굴지하는 간단한 바인딩, 분석의 그러나 이러한 유형에 따라 정교하고 F - 굴지에 단백질이나 단백질 도메인의 결합 특이성을 결정하는 데 사용할 수를 증명하고있다.

굴지 공동 침강 분석, f - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

세포 내에서 굴지의 cytoskeleton는 세포와 세포 프로세스의 움직임을 허용 굴지의 필라멘트의 네트워크이며, 그것은 긴장을 생성하고 세포 모양을 유지하는 데 도움이됩니다. 굴지의 cytoskeleton는 단단한 구조로되어 있지만, 지속적인 리모델링있는 역동적인 구조입니다. 단백질의 숫자는 굴지의 cytoskeleton에 바인딩할 수 있습니다. F - 굴지 특정 단백질의 바인딩은 종종 세포 생물 학적 관찰을 지원하거나 추가로 굴지의 cytoskeleton의 리모델링으로 인해 역동적인 프로세스를 이해하기 원하는 것입니다. 굴지 공동 침강 분석은 정기적으로 특정 단백질이나 F - 굴지와 단백질 도메인의 바인딩을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다. 분석의 기본 원칙은 F - 굴지과 관심의 단백질의 부화 (의 전체 길이 또는 도메인), F - 굴지 공동 sedimenting 단백질의 펠렛 F - 굴지 및 분석 ultracentrifugation 단계를 포함하고 있습니다. 굴지 공동 침강 assays는 굴지 바인딩 동질성 및 경쟁 assays을 측정하기 위하여 적절하게 설계할 수 있습니다.

단백질은 별개의 굴지 구속력이 모듈을 통해 filamentous 굴지 (F - 굴지)에 바인딩합니다. 이 비디오에서 우리는 굴지의 절차를 정기적으로 단백질이나 F - 굴지 바인딩 특정 도메인을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다 공동 침전을 보여줍니다.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

세포 내의 액틴 세포골격은 세포의 이동과 세포 내 프로세스를 가능하게 하며, ...를 생성하는 액틴 필라멘트의 네트워크입니다.

세포 내에서 액틴 세포골격(Actin Cytoskeleton)은 동적인 구조이며, 이에 대한 재구성은 세포 분열, 세포 이동 및 물리적 운송에 이르는 다양한 과정에서 중요합니다. 매우 다양한 단백질들이 서로 다른 액틴 결합 모듈을 통해 액틴 세포골격에 결합할 수 있습니다.본 영상에서는 필라멘트状 액틴과 결합하는 단백질 또는 단백질의 특정 도메인을 분석하기 위해 일상적으로 사용되는 인비트로(in vitro) 분석법인 액틴 공동 침전법의 절차를 시연합니다. 안녕하세요, 저는 UCSF 세포 및 조직 생물학과의 Dr. Diane Barber 연구실 소속 Jody Var입니다. 이번 영상에서는 액틴 공동 침전 분석을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.이 절차는 섬유성 액틴(filamentous actin)에 특이적으로 결합하는 단백질을 분석하는 한 가지 방법이며, 결합 친화도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차는 액틴 필라멘트의 형성 및 테스트할 단백질의 준비, 관심 단백질과 섬유성 액틴(약칭 f actin)의 함께 배양, 초원심분리기를 이용한 100,000 ×g에서의 F actin 침전, 그리고 상층액과 침전 분획을 시각화하기 위한 SDS page 및 코클린(coochin) 염색 단계를 포함합니다.마지막으로, 펠렛 분획에서 f actin과 함께 공침전되는 단백질을 분석하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 액틴 필라멘트를 준비하기 위해서는, 사용 중인 액틴이 단량체 형태인지 확인하는 것이 바람직합니다.10 mg/mL 농도의 액틴(actin) 스톡 용액을 -80°C 냉동고에서 꺼내어, tris, calcium chloride, 단량체 안정화를 위한 ATP 및 DTT가 포함된 버퍼를 사용하여 2.4 mg/mL의 작업 희석액을 조제합니다. 작업 희석액을 얼음 위에 두고 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 액틴 용액을 4°C에서 14,000 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다.결과물인 상층액이 단량체 액틴이 됩니다. 이제 정제된 액틴 단량체에 염화 칼륨, 염화 마그네슘 및 TP를 첨가하고 1시간 동안 반응시키면 섬유상 액틴을 생성할 수 있습니다. 실온에서 섬유상 액틴이 준비되면, 다음 단계에서 보여드릴 관심 단백질 또는 단백질 도메인과 함께 배양할 수 있습니다.actin 공동 침전 분석을 진행하기 위해, 테스트할 단백질을 준비해야 합니다. 오늘은 GST 융합 단백질로 정제된 clathrin을 사용하겠습니다. 이 단백질은 초원심분리를 통해 응집체를 미리 제거하였으며, 결과물인 상층액을 이제 분석에 사용할 준비가 되었습니다.액틴에 대한 단백질 결합을 테스트하기 위해서는 액틴이 과량으로 존재해야 합니다. 이 실험에서는 tris, ATP, β-mercaptoethanol, EDTA, calcium chloride가 포함된 버퍼 내에서 10 $\mu\text{g}$의 액틴과 5 $\mu\text{g}$의 단백질을 함께 배양하여 총 부피 150 $\mu\text{L}$가 되도록 합니다. 단백질-액틴 배양은 초원심분리기 튜브 내에서 실온으로 1시간 동안 직접 수행합니다. 튜브 1과 2는 대조군 튜브입니다. 튜브 1에는 버퍼 내의 액틴만 포함되어 있습니다.두 번째 튜브에는 완충액에 단백질만 포함되어 있습니다. 세 번째 튜브에는 완충액 2 내에 actin과 talin의 CNU가 모두 포함되어 있습니다. 네 번째는 비특이적 결합을 확인하기 위한 추가 대조군으로, actin과 GST 단백질만 포함되어 있습니다. 1시간의 배양 후, 샘플을 Beckman 로터에 조심스럽게 넣습니다.그 다음 초원심분리기를 100,000 ×g로 설정하고 22 °C에서 20분 동안 샘플을 원심분리합니다. 이 원심분리 과정 후에 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플 준비가 완료되었습니다. 20분간의 원심분리가 끝나면, 펠렛이 흐트러지지 않도록 로터에서 샘플을 조심스럽게 꺼냅니다. 펠렛이 위치한 튜브 측면에 표시를 합니다.상층액을 5× SCS 샘플 버퍼가 들어 있는 Eppendorf 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 초원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿에 1× SCS 샘플 버퍼를 추가합니다. 피펫팅으로 섞어준 후, 재현탁된 펠릿을 새로운 Eppendorf 튜브로 옮깁니다.그 다음 샘플을 가열 블록에서 최대 10분 동안 가열합니다. 가열 후 샘플을 SDS page 젤에 로딩합니다. 여기서는 이미 준비된 10% 젤을 사용하겠습니다.샘플을 정확한 순서대로 웰에 주의하여 로딩합니다. 겔을 상온에서 약 1시간 동안 일정 전압으로 전기영동합니다. 전기영동이 완료되면, 단백질을 시각화하기 위해 쿠마시 블루(kumasi blue)로 염색합니다.Kumasi blue 용액이 겔을 완전히 덮어야 합니다. 겔을 쉐이커에 넣고 최소 20분 동안 둡니다. 그 후 ESI blue 용액을 제거하고 겔을 탈색 용액에 담급니다.밴드가 보일 때까지 셰이커 위에서 약 한 시간 동안 젤을 방치합니다. 쿠마시 염색 후, 젤을 분석하여 상층액과 펠렛 분획의 상대적인 단백질 양을 결정할 수 있습니다. 1번과 2번 레인에 나타난 젤을 보면, 액틴만 포함된 상층액과 펠렛 분획을 확인할 수 있습니다.3번과 4번 레인에는 C-tail 단백질 단독의 상층액 및 펠렛 분획이 포함되었습니다. 5번과 6번 레인에는 actin과 C-tail의 배양 후 상층액 및 펠렛 분획이 포함되었습니다. 7번과 8번 레인에는 actin과 GST 단백질 배양 후의 상층액 및 펠렛 분획이 포함되었습니다.보시는 바와 같이, 꼬리 부분의 CT는 6번 레인의 palate 분획에서만 관찰됩니다. 이 겔의 결과는 C-말단인 꼬리 부분이 acton에 특이적으로 결합함을 나타냅니다. 본 영상에서는 Acton 공동 침전 분석법을 수행하는 방법을 살펴보았습니다.액틴 공침전 분석법(Actin Co sedimentation assays)은 액틴 결합 단백질을 분석하기 위한 인 비트로(in vitro) 방법입니다. 이 절차를 수행할 때 다음 사항을 기억하는 것이 중요합니다. 관심 단백질을 사전 제거(pre-clear)하고, 모든 단백질-액틴 배양 단계마다 단백질 단독 음성 대조군을 포함시켜야 합니다.이 대조군은 사전 제거된 단백질이 자체적으로 침전되는지 여부를 보여줄 것이며, f에 결합하는 일부 단백질의 작용이 버퍼의 pH, 온도 또는 염 농도에 민감할 수 있음을 나타냅니다. 이것으로 모든 내용을 마칩니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

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연구

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생물학

우리는 적용 레이블이없는 운동 특성을 통해 papain 여러 cystatin B로 돌연변이의 바인딩의 구조 - 기능 분석을위한 Biacore의 X100을 사용하여 단백질 상호 작용 분석. 보정이없는 농도 분석 (CFCA)는 표준 곡선을위한 필요없이 유지 바인딩 활동으로 단백질의 농도를 측정합니다. 우리는 CFCA의 운동 분석의 신뢰성을 증가하고 운동 상수가 안정적으로 재조합 단백질의 활동이 감소하더라도 확인할 수 있습니다 사용하는 농도의 확인을 보여줍니다.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

이 동영상은 기질 강성에 따른 변형을 이해하기 위해 원발성 인간 대장암 세포의 세포골격 및 국소 접착을 연구하는 기술을 설명합니다. 연질 및 경질 기질에서 암세포를 배양하면 암 예후를 위한 다양한 다운스트림 생물물리학적 측정이 가능합니다.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

FtsZ의 중합은 박테리아 세포 분열에 필수적입니다. 이 보고서에서는 FtsZ 중합 활성을 모니터링하기 위한 간단한 프로토콜에 대해 자세히 설명하고 버퍼 조성의 영향에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 FtsZ 중합에 영향을 미치는 조절 단백질 또는 항균 약물과 FtsZ의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

이 프로토콜은 필라멘트 액틴 (F - 굴지)과 함께 공동 침강하는 단백질의 능력을 테스트하는 방법을 설명하고, 바인딩이 관찰되면 상호 작용의 친화력을 측정하는 방법을 설명합니다.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

진급하려면 성장 콘이 외부 환경에 대한 견인력을 발휘해야 합니다. 견인력의 생성은 액틴 역학 및 클러치 커플링에 의존합니다. 본 연구는 성장 콘 발전을 위한 액틴 역학, 클러치 커플링 및 견인력을 분석하는 방법을 설명합니다.

액틴 다이내믹스, 클러치 커플링, 성장 콘 발전을 위한 견인력 분석

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질 성분을 사용하여 구슬 표면에 액틴 혜성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 시스템은 세포에서 발견되는 돌출 구조를 모방하고 단순화 된 방식으로 힘 생산의 생리적 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

배우세요 액틴 공동 침강 분석법을 사용하여 F-액틴에 결합하는 단백질을 분석하는 방법을 익히세요. 이 체외 분석 기법은 세포골격 역학과 단백질 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

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