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인도 생명공학부(DBT), 인도 의학연구위원회(ICMR) 및 과학공학연구위원회(SERB)의 지원에 감사드립니다.

사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. Mycobacterium 배양
<ol>
	<li>0.2% 글리세롤, 0.05% Tween 80 및 10% ADC가 첨가된 10mL의 Middlebrook 7H9 배지에 Msmeg 또는 Mtb 글리세롤 스톡 1mL를 접종한다. 37 °C OD가 1–1.5에 도달할 때까지 150 rpm으로 진탕하며 배양한다.</li>
	<li>1차 배양액의 1%를 10 mL의 7H9 배지에 첨가하여, OD가 mid-log 단계에 도달할 때까지 2차 배양을 진행하십시오.600nm = 0.6–0.7.</li>
	<li>3 mL씩 분주한 후, 배양액을 2000 x g에서 원심분리하십시오. g 실온(23–25 °C).</li>
	<li>펠릿을 - 에서 보관하십시오.80 °C RNA 추출 전까지. 
	주의: Mtb 배양물의 경우, 적절한 BSL3 지침을 준수하고 펠릿을 95 ˚C에서 20~25분 동안 가열 불활성화하십시오. 
	참고: 그림 1 Hot Phenol법을 이용한 RNA 추출 과정의 기본 단계를 나타낸 흐름도입니다.</li>
</ol>
<img alt="열-페놀 RNA 추출 도식; 워크플로우는 원심분리, 상 분리, RNA 무결성 분석을 보여줌." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig1.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="그림 1"> 
그림 1: 열-페놀 방법 및 분석의 모식도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig1large.jpg" target="_blank">여기에서 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>
2. RNA 추출
<ol>
	<li>고온 페놀법 (HP method)
	<ol>
		<li>세포 펠렛에 200 µL의 TES 완충액 (100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 5 mM EDTA, pH 8.0; 0.1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoethanol)을 넣고 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁한다.</li>
		<li>시료에 약 0.1 g의 0.1 mm 실리카 비드를 추가한다. 펠렛이 얼음 위에서 완전히 해동될 때까지 핸드헬드 조직 분쇄기를 10~15초 동안 사용한다. 이 단계를 2회 더 반복하며, 각 반복 후에는 액체 질소로 급속 냉동시킨다.</li>
		<li>또는 상온에서 고속 탁상형 비드 파쇄기를 속도 설정 5 (5.0 m/s)로 1분 동안 사용한다. 이 단계를 3회 반복하고, 가열을 방지하기 위해 매 사이클 후 시료를 얼음 위에서 배양한다. 
		참고: 핸드헬드 조직 분쇄기나 비드 파쇄기를 사용하여 Mtb 세포 용해를 6~8회 반복(각 사이클당 1분)하고, 매 사이클 후 간헐적으로 얼음 위에서 냉각한다. RNA 추출에 필요한 모든 완충액과 시약 준비에는 DEPC (Diethylpyrocarbonate) 처리된 물을 사용한다.</li>
		<li>각 시료에 65 °C로 예열된 TES 완충액 200 µL를 추가하여 총 부피를 400 µL로 맞춘다. 각 시료에 산성 페놀 (100 mM 시트르산 완충액, pH 4.5로 평형을 맞춘 페놀) 200 µL와 클로로포름 200 µL를 추가한다 (산성 페놀과 클로로포름을 동일한 비율로 혼합한 후 시료에 첨가한다).</li>
		<li>시료를 히트 블록 위에서 65 °C로 900 rpm으로 흔들어주며 30분 동안 배양하고, 상온에서 12,000 x g으로 15분 동안 원심분리한다. 원심분리 후 적절한 층 분리가 이루어졌는지 확인한다 (RNA가 포함된 투명한 상층 수성층, 뚜렷한 DNA 중간층, 단백질과 지질이 포함된 하층 유기층이 관찰된다).</li>
		<li>수성층의 상층을 제거하여 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다. 산성 페놀:클로로포름 혼합액을 동일한 부피로 다시 추가한다. 상온에서 12,000 x g으로 15분 동안 원심분리한다. 적절한 층 분리를 확인한다.</li>
		<li>상층 수성층을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 3 M 아세트산 나트륨 완충액(pH 5.3) 30 µL와 냉각된 이소프로판올 240 µL를 추가한다. −80 °C에서 30분~1시간 동안 배양한다. 
		참고: 이 단계에서 마이크로 원심분리 튜브를 -80 °C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있다. 65 °C 배양 중 튜브가 열리는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 여러 겹 밀봉한다. 
		주의: 페놀과 클로로포름은 위험한 화학 물질이므로, 적절한 개인 보호 장구(PPE), 흄 후드와 같은 공학적 제어 장치 및 특정 폐기물 처리 절차를 준수해야 한다.</li>
		<li>상온에서 12,000 x g으로 1시간 동안 원심분리한다. 펠렛이 형성되었는지 확인하고 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거한다.</li>
		<li>펠렛을 1 mL의 75% 에탄올에 재현탁하고 상온에서 12,000 x g 으로 1분 동안 원심분리한다. 이 단계를 2회 수행하고 펠렛을 공기 건조시킨다.</li>
		<li>펠렛을 50 µL의 뉴클레아제-프리 워터에 재현탁한다. 
		​참고: RNA를 용해하려면 RNase-프리 워터에 넣고 상온에서 10~30분 동안 배양한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TRIzol 방법
	<ol>
		<li>세포 펠렛에 200 µL의 TRIzol 시약을 추가한다. 
		주의: TRIzol은 위험한 화학 물질이므로, 적절한 개인 보호 장구(PPE), 흄 후드와 같은 공학적 제어 장치 및 특정 폐기물 처리 절차를 준수해야 한다.</li>
		<li>단계 2.1.2 - 2.1.3에 기술된 세포 용해 방법을 따른다.</li>
		<li>TRIzol 시약 200 µL를 추가로 넣은 후, 클로로포름 200 µL를 추가하고 1분 동안 볼텍싱한다. 4 °C에서 13,400 x g으로 15분 동안 원심분리한다. 원심분리 후 적절한 층 분리를 확인한다.</li>
		<li>수성층을 조심스럽게 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴다.</li>
		<li>수성층에 500 µL의 이소프로판올을 추가하고 −80 °C에서 30분~1시간 동안 배양하여 RNA를 침전시킨다.</li>
		<li>4 °C에서 15,000 x g으로 20분 동안 원심분리하여 RNA를 펠렛화한다. 펠렛을 주의 깊게 관찰하고 펠렛이 흐트러지지 않도록 상층액을 제거한다.</li>
		<li>펠렛을 1 mL의 75% 에탄올로 재현탁하고 4 °C에서 13,400 x g 으로 1분 동안 원심분리한다. 이 단계를 2회 반복하고, 상온에서 30분 동안 펠렛을 공기 건조시킨 후 50 µL의 뉴클레아제-프리 워터에 재현탁한다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>상용 RNA 추출 키트 방법
	<ol>
		<li>세포 펠렛을 200 µL의 재현탁 완충액(키트에 제공됨)에 재현탁한다.</li>
		<li>단계 2.1.2 - 2.1.3에 기술된 세포 용해 방법을 따른다.</li>
		<li>제조사의 지침에 따라 후속 실험을 수행한다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DNase 처리, 정량 및 시각화
<ol>
	<li>게놈 DNA 오염을 제거하기 위해, 각 RNA 샘플에 DNase I (10units) 1 µL와 RDD buffer (1x) 5 µL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>Nanodrop을 사용하여 RNA 샘플을 분광 광도법으로 정량하고, Qubit4를 사용하여 RNA 무결성을 측정한다. RIN의 허용 범위는 7.5-10 사이이다. A260/A280 및 A260/A230의 허용 값은 각각 1.8–2.0 및 2.0–2.2 범위이다.</li>
	<li>1X RNA loading dye를 사용하여 1% 아가로스 겔에서 RNA를 시각화한다.</li>
</ol>
4. cDNA 합성 및 정량적 실시간 PCR 
<ol>
	<li>제조사의 지침에 따라 cDNA Reverse Transcription 키트와 1 µg RNA를 사용하여 서멀 사이클러에서 cDNA 준비를 위한 20 µL 반응을 설정한다.</li>
	<li>제조사의 지침에 따라 50 ng의 cDNA, 각 0.4 µM의 프라이머 및 SYBR을 사용하여 10 µL 리얼타임 PCR 반응을 설정한다. Real-Time PCR 서멀 사이클러에서 샘플을 가동한다. 
	참고: qPCR 분석을 위해 다음 프라이머가 사용되었다: 
	Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3' 
	Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3' 
	Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3' 
	Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3' 
	Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3' 
	Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'</li>
</ol>
5. 통계 분석
<ol>
	<li>Student's t-검정을 수행하십시오. t-검정 Graph Pad Prism을 사용하여 모든 생물학적 반복 실험군과 함께, P p ≤ 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 오차 막대는 최소 3회 이상의 생물학적 반복 실험에서 얻은 표준 오차를 나타낸다.</li>
</ol>

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</ol>

저자들 간의 이해상충은 없었습니다. 모든 저자가 제출을 승인하였습니다.

Mycobacterium을 위한 간단하고 견고한 RNA 추출 방법을 개발하기 위해 Hot Phenol 방법이 최적화되었습니다. 이어서, 추출된 RNA를 널리 사용되는 두 가지 방식인 TRIzol 및 컬럼 기반 키트 방법12,13과 비교하였습니다. 하위 분자 생물학적 응용 분야에서의 실용성을 평가하기 위해 RNA 수율, 순도, 무결성, 비용 및 처리 시간을 기준으로 이러한 기술들을 비교했습니다. Hot Phenol과 TRIzol 방법은 키트 기반 방법에 비해 상대적으로 시간이 많이 소요되었으나, 손상되지 않은 고품질의 RNA를 생성했습니다. 세 가지 방법 모두 유사한 순도와 무결성을 가진 RNA를 얻었으나, Hot Phenol 방법이 일관되게 더 높은 RNA 수율을 제공했습니다. 또한, Hot Phenol과 TRIzol을 사용하여 추출한 RNA는 유사한 Ct 값을 나타냈습니다. 그러나 Hot Phenol 방법과 RNeasy 방법 사이에는 Ct 값에서 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 실험에 동일한 양의 RNA를 사용했으므로 모든 방법에서 유사한 Ct 값이 기대되었습니다. RNeasy 방법에서 관찰된 차이는 RNA 추출 화학 반응의 차이 때문일 수 있습니다. Hot Phenol과 TRIzol은 유기 용매 기반 방법으로, 내재성 막 단백질을 인코딩하는 전사체나 GC 함량이 높은 전사체와 같이 용해시키기 어려운 전사체를 용해시키는 데 더 효과적인 경우가 많습니다. 반면, RNeasy는 실리카 컬럼 기반 방법으로, 페놀 기반 방법과 비교했을 때 막에 효율적으로 결합하지 않거나 세척 단계에서 손실되는 특정 전사체의 회수율이 낮아질 수 있습니다(그림 2). 중요한 점은, 세포 용해를 위해 핸드헬드 조직 분쇄기(hand-held tissue grinder) 또는 비드 럽터(bead ruptor) 중 어느 것을 사용해도 유사한 RNA 수율을 얻었으며, 이를 통해 세포 용해 수행 시 운영상의 유연성을 확보했다는 것입니다. 또한, 추출 방법은 적은 배양 부피에서도 작동하고 냉장 원심분리가 필요하지 않도록 최적화되었습니다. 이러한 간소화는 시료 처리의 전반적인 편의성과 효율성을 높여줍니다.
RNA 추출 방법을 선택할 때 중요한 요소는 비용, 시간, 그리고 결과물의 품질 사이의 균형을 맞추는 것입니다(Table 1). Hot Phenol 방법은 시간이 다소 소요됨에도 불구하고, 일반적인 실험실 화학 물질을 사용하고 높은 RNA 수율(3 mL의 중간 대수 성장기 배양 부피당 Msmeg RNA 60–70 µg 및 Mtb RNA 35–45 µg)을 얻을 수 있어 매우 비용 효율적이며, 지금까지 발표된 대부분의 방법에서 사용된 고가의 비드 파쇄 장비 없이도 3 mL의 적은 배양 부피에서 추출이 가능합니다. 이는 특히 자원이 부족한 환경에서 운영되는 실험실에 매우 유리합니다. 이전에 발표된 hot phenol 기반 RNA 추출 방법들은 몇 가지 주요 측면에서 차이가 있습니다. 예를 들어, Mangan 등은 hot phenol 방법을 사용하여 M. bovis에서 RNA를 추출했으며, 109 cells당 약 20 µg의 RNA 수율을 보고했습니다. 그러나 배양 부피 및 추출 온도와 같은 중요한 파라미터가 명확하게 명시되지 않았습니다. 또한, 그들의 방법은 기계적 세포 파쇄 전에 쉽게 구할 수 없는 시약인 Divolab-1을 이용한 계면활성제 세척 과정이 포함되며, 이후 chloroform 및 isoamyl alcohol로 추출을 진행합니다11. 또 다른 Hot Phenol 방법에서는 Mtb 세포에서 RNA를 추출하여 약 39 µg의 총 RNA를 얻었으며, 이는 본 논문에서 설명하는 최적화된 방법과 유사한 수준입니다. 하지만 이 방법은 상대적으로 많은 배양 부피(25 mL)가 필요하여 처리 시간이 증가하고 더 큰 원심분리기를 사용해야 했습니다. 더욱이, 추출 과정에 chloroform–isoamyl alcohol 혼합물이 사용되며, 추출 온도는 보고되지 않았습니다12,14. TRIzol 또한 적당한 비용으로 좋은 RNA 수율과 품질을 얻기 위해 널리 사용되지만15, 수율은 상대적으로 낮았습니다. RNeasy 키트는 편의성과 속도가 뛰어나 시간 제약이 있는 작업 흐름이나 숙련도가 낮은 사용자에게 적합하지만, 다른 두 방법보다 비용이 상당히 높고 수율이 현저히 낮았습니다. 요약하자면, 본 연구에서 설명하는 방법은 마이코박테리아 세포 용해 및 후속 RNA 추출에 있어 운영상의 유연성을 제공합니다. 이를 통해 사용자는 세 가지 방법 모두에서 유사한 RNA 품질과 무결성을 유지하면서 비용과 수율, 또는 처리 시간 등 우선순위에 따라 가장 적합한 방법을 선택할 수 있습니다.

M. tuberculosis (Mtb)는 결핵(TB)의 원인균으로, HIV/AIDS를 넘어 단일 감염성 병원체로 인한 사망 원인 1위를 차지하고 있습니다. 2024년 기준, 전 세계적으로 결핵으로 인해 약 130만 명이 사망했습니다1. 이러한 부담은 다제내성(MDR) 및 광범위 약제내성(XDR) 균주의 유병률 증가로 인해 더욱 심화되고 있습니다. 따라서 결핵 병인 기전의 분자적 기초를 이해하고 새로운 치료 표적을 발굴하는 것이 시급합니다2.
Mtb의 전사 프로파일링은 숙주-병원체 상호작용3, 환경적 스트레스에 대한 적응4, 그리고 약제 내성의 기저 기전5에 관여하는 기능적 요소들을 규명하는 중요한 도구가 되었습니다. 실시간 PCR, 마이크로어레이 및 RNA 시퀀싱(RNA-seq)과 같은 고급 방법론들은 마이코박테리아 전사체를 분석하는 능력을 크게 향상시켰습니다6. 하지만 이러한 방법들의 성공 여부는 고품질 RNA의 확보 가능성에 크게 좌우되며, 이는 다시 추출 과정 중의 효율적인 세포 용해에 달려 있습니다. Mtb의 복잡한 mycolyl–arabinogalactan–peptidoglycan 세포벽은 RNA 추출을 특히 어렵게 만듭니다7. 효소 가수분해8, 초음파 처리9, 비드 비팅10을 포함한 기존의 용해 기술들은 종종 고가의 장비와 많은 배양 부피를 필요로 하며, 이는 많은 BSL-3 실험실에서의 실용성을 제한합니다. 또한, Mtb의 느린 성장 속도로 인해 충분한 바이오매스를 얻기 위해서는 장기간의 배양 시간이 필요합니다11.
이러한 한계를 극복하기 위해, 신속하고 경제적인 최적화된 Hot Phenol 기반 RNA 추출법이 개발되었습니다. 로그 증식기(mid-log phase) 배양액 3 mL만을 사용하여, 하위 전사체 분석에 적합한 고품질의 RNA를 45–60 µg 얻을 수 있습니다. 세포 용해는 소형 휴대용 조직 분쇄기와 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하여 수행하므로 고가의 장비가 필요하지 않습니다. Hot Phenol 방법은 이전에 보고된 바 있으나11,12, 최적화된 Hot Phenol 방법은 편의성, 비용 효율성 및 RNA 수율을 개선하였습니다. 최적화는 M. smegmatis mc2155 (Msmeg)를 사용하여 수행되었으며, Mtb H37Rv를 통해 성공적으로 검증되었습니다.

<table><tbody><tr><td>0.1 mm 실리카 비드</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP116911050</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor 4&amp;nbsp;</td><td>revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>저온 원심분리기</td><td>ThermoScientific</td><td>42541217</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>sigma</td><td>E02SS</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SRL</td><td>62889</td><td></td></tr><tr><td>히팅 블록</td><td>MIULAB</td><td>MU-E02-1049</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>모터 구동식 조직 분쇄기 G10</td><td>Coron</td><td>G22616008</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometer N50&amp;nbsp;</td><td>IMPLEM</td><td>T51601</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 시트르산 완충액(pH 4.5)으로 평형화된 페놀</td><td>Sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 형광 광도계&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2.32262E+12</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR 열 순환기</td><td>Analytik Jena AG</td><td>844-00503-2</td><td></td></tr><tr><td>RNA easy Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>621BR29739</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>516732</td><td></td></tr></tbody></table>

마이코박테리아로부터의 최적화된 핫 페놀 기반 rna 추출: 신뢰할 수 있는 유전자 발현 분석을 위한 강력한 방법론

Optimized Hot Phenol&#8211;Based RNA Extraction from Mycobacteria: A Robust Approach for Reliable Gene Expression Analysis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 여전히 전 세계적인 주요 보건 위협으로 남아 있으며, 이는 Mtb의 생물학 및 약제 내성 기전을 이해하기 위한 신뢰할 수 있는 전사체 연구의 필요성을 강조합니다. 이러한 분석은 고품질, 고수율의 RNA를 확보하는 것에 달려 있습니다. 여러 RNA 추출 방법이 존재하지만, 많은 방법이 고가의 시약, 대량의 배양액 또는 특수 장비를 필요로 하여, 특히 자원이 제한된 환경에서 대규모 연구에 적용하기에는 한계가 있습니다. 본 논문에서는 마이코박테리아에 특화되어 최적화된 Hot Phenol 기반 RNA 추출 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 배양액과 흔히 사용 가능한 시약을 사용하여 고처리량 전사체 분석 응용에 적합한 고품질 RNA를 일관되게 추출합니다. RNA의 양과 무결성은 젤 전기영동 및 RNA 무결성 분석 (RIN)을 통해 평가하였으며, 후속 응용 분석에 대한 적합성은 qPCR 및 Qubit 4로 확인하였습니다. 최적화된 방법의 성능을 벤치마킹하기 위해, 동일한 Mycobacterium 종, 배양액 부피, 성장 단계(대수 증식기 및 정지기) 및 용해 조건을 포함한 동일한 실험 조건 하에서 TRIzol 및 RNeasy를 이용한 병행 RNA 추출을 수행하였습니다. 이를 통해 수율, 품질, 실행 가능성 및 비용을 직접적으로 비교할 수 있었습니다. 최적화된 Hot Phenol 방법은 시약 비용과 특수 장비 의존도를 크게 낮추면서도, 이에 상응하거나 더 향상된 RNA 수율과 품질을 보여주었습니다. 효율성, 재현성 및 경제성 덕분에, 이 프로토콜은 Mtb 및 기타 마이코박테리아 종의 대규모 유전자 발현 및 전사체 연구를 위한 실용적인 대안을 제공합니다.

RNA 품질 및 수율
아가로스 겔 전기영동을 통해 RNA의 품질과 양을 평가하였다(그림 2). 모든 추출 방법에서 23S 및 16S rRNA에 해당하는 뚜렷하고 선명한 밴드가 관찰되어, 총 RNA가 성공적으로 분리되었음을 확인하였다. Hot Phenol 및 TRIzol 방법에서는 23S (~2900 bp), 16S (~1500 bp), 5S rRNA (~120 bp)를 나타내는 세 개의 명확한 밴드가 관찰되어, RNA가 손상되지 않은 고품질임을 나타냈다. 반면, 컬럼 기반 키트 방법에서는 23S와 16S 밴드만 관찰되었고 5S rRNA 밴드는 나타나지 않았거나 검출 한계 미만이었는데, 이는 컬럼 정제 과정에서 소형 RNA가 우선적으로 손실되었기 때문으로 보인다. 정량적으로 Hot Phenol 방법은 TRIzol 및 RNeasy보다 각각 1.5~2배 더 많은 RNA를 수득하였다(그림 2A,C). 평균 수득량은 Hot Phenol이 ~60 µg, TRIzol이 ~45 µg, RNeasy가 ~30 µg였으며, RNeasy는 Hot Phenol보다 수득량이 약 50% 낮았다. 이러한 수득량 차이에도 불구하고 RNA의 무결성과 순도는 모든 방법에서 유사하였다(그림 2D,E).
용해 방식의 효율성을 평가하기 위해 비드 럽터(bead ruptor)를 사용하여 RNA를 추출하였습니다. 그 결과 유사한 수율, 품질 및 무결성이 확인되었으며, 이는 비드 럽터/비터(bead ruptor/beater)와 같은 전문 장비에 의존하지 않고 단순한 수동 조직 분쇄기만으로도 효과적인 용해가 가능함을 입증합니다(그림 2B, F–H).
Mtb는 Msmeg보다 용해에 더 강한 저항성을 가지므로, Mtb H37Rv 균주를 사용하여 최적화된 Hot Phenol 방법을 추가로 검증했습니다. 조직 분쇄기와 비드 파쇄기를 모두 사용하여 세포 용해를 진행한 결과, RNA의 수율, 품질 및 무결성이 양호하게 나타났으며(그림 3A–D), 이를 통해 해당 방법의 견고함을 확인했습니다. 수동 조직 분쇄기를 이용한 RNA 추출 수율(~35–45 µg/3 mL 배양액)은 비드 파쇄기(50–60 µg/3 mL)에 비해 낮았으나, 그 차이는 통계적으로 유의미하지 않았으며, 대규모 유전자 발현 연구에 충분한 허용 범위 내의 양이었습니다. 모든 RNA 추출은 여러 번 반복되었으며, 모든 독립적인 생물학적 반복 실험 결과가 제시되었습니다. 겔 이미지에 대해 밀도 분석(Densitometry analysis)을 수행하여 서로 다른 방법 간의 RNA 수율에 대한 통계적 차이를 추가로 검증하였으며, Hot Phenol 방법이 가장 높은 수율을 보였습니다(보충 그림 1A–D).
RNA 순도 및 무결성
모든 방법에서 2.0 내외의 허용 가능한 A260/A280 비율의 RNA가 얻어졌으며, 이는 단백질 오염이 최소화되었음을 나타냅니다(그림 2D). RNA 무결성(RIN)은 모든 방법에서 유사하게 나타났으며, 값은 7.5에서 10 사이였습니다(그림 2D–H, 부록 그림 2, 하단 패널). 이는 우수한 품질과 무결성, 그리고 최소한의 분해가 이루어졌음을 의미합니다.
RNA 품질 확인을 위한 정량적 PCR 분석 
각 방법으로 추출한 RNA가 하위 유전자 발현 연구에 적합한지 평가하기 위해 qRT-PCR을 수행하였습니다. 동일한 양의 RNA 입력을 사용하여 Msmeg 하우스키핑 유전자인 mysA (MSMEG 2758)와 두 가지 전사 조절 인자인 sigE (MSMEG 5072) 및 sigH (MSMEG 1914)의 유전자 발현을 연구하였습니다. 얻어진 Ct (cycle threshold) 값은 각 샘플 내에 존재하는 온전하고 증폭 가능한 RNA의 상대적 양을 반영합니다. (그림 2I)에서 보듯이, Hot Phenol과 TRIzol을 사용하여 추출한 RNA는 약 22–25 범위의 유사한 Ct 값을 나타냈으며, 이는 더 높은 RNA 무결성과 역전사 및 증폭과의 호환성을 반영합니다. 반면, 키트 방법은 약간 더 높은 Ct 값(~27–30)을 보여 검출 가능한 전사체 수준이 더 낮음을 나타냈습니다. 융해 곡선 분석 결과, mysA, sigE, 및 sigH 유전자의 특이적 증폭이 확인되어 qPCR의 특이성과 효율성을 입증하였습니다 (부록 그림 2, 상단 패널). Mtb 유전자를 이용한 qPCR 분석에서도 수용 가능한 Ct 값(~20–25)이 나타나 하위 유전자 발현 연구에 적합함을 확인하였습니다 (그림 3E).
<img alt="RNA 추출 비교; 겔 전기영동(28S, 18S, 5S) 및 수율, Ct 값, 순도의 막대그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="그림 2"> 
그림 2~를 위한 RNA 추출 방법 비교 마이코박테리움. (A) Hot Phenol, TRIzol 및 RNeasy 방법으로 추출한 총 RNA를 나타내는 아가로스 겔 전기영동 결과. 모든 시료에서 뚜렷한 23S 및 16S rRNA 밴드가 관찰되며, 이는 RNA가 손상되지 않았음을 나타낸다. (B) Hot Phenol을 사용하여 추출한 총 RNA를 보여주는 아가로스 겔 전기영동 ~을 통해 다양한 용해 방법, 즉 비드 럽터(bead ruptor)와 수동 조직 분쇄기를 사용합니다. (C) 총 RNA 수율로, Hot Phenol에서 가장 높은 수율을 보였으며 TRIzol과 키트 방식이 그 뒤를 이었다. (DRNA 순도는 A260/A280 비율로 평가하였으며, 모든 방법에서 약 2.0의 값이 도출되어 단백질 오염이 최소화되었음을 나타냈다.E) 유사한 무결성을 나타내는 RNA 무결성 지수(RIN). (F–H) 핸드헬드 조직 분쇄기(hand-held tissue grinder)와 Bead Ruptor로 용해하고 Hot Phenol 방법으로 분리한 샘플 간의 RNA 수율, 260/280 비율 및 RNA 무결성 비교. (I) 하우스키핑 유전자(예: mysA) 및 전사 인자 (sigE 및 sigH). 오차 막대는 3회의 생물학적 반복 실험(n = 3)으로부터 얻은 표준 오차를 나타냅니다. PStudent's t-검정을 사용하여 계산된 p-값 t-검정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig2largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Mycobacterium RNA 추출 비교, 겔 전기영동 및 수율과 순도를 분석한 막대 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69006/69006fig3.jpg" data-altupdatedat="1789444946000" data-alt="그림 3"> 
그림 3: hot phenol법을 이용한 Mtb의 RNA 분리. (A) 최적화된 Hot Phenol법을 사용하여 Mtb H37Rv 균주로부터 bead ruptor와 수동 조직 분쇄기로 추출한 총 RNA의 아가로스 겔 전기영동 결과. (B–D) 분리된 RNA의 수율, 260/280 비율 및 RNA 무결성(RIN) 추정치 비교. (E) sigA, 16s rRNA 및 hsp70 유전자를 타겟으로 한 qRT-PCR의 Ct 값. 오차 막대는 3회의 생물학적 반복 실험(n = 3)에 대한 표준 오차를 나타냄. P-값은 Student’s t-test를 사용하여 계산됨. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/69006fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>가열 페놀</td>
			<td>Trizol</td>
			<td>RNeasy 키트</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>수율</td>
			<td>60 -70 μg</td>
			<td>35 -50 μg</td>
			<td>30 - 45 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시간</td>
			<td>2.5-3시간</td>
			<td>2-2.5시간</td>
			<td>30-45분</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>반응당 비용</td>
			<td>$0.10 – $0.20</td>
			<td>$1.500 – $2.00</td>
			<td>$7.00 – $10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>한계점</td>
			<td> 시간 소모적이며 강력한 변성제(phenol/SDS)를 사용하는 방식</td>
			<td> 많은 시간이 소요됨, Trizol과 같이 독성이 매우 강한 시약 사용, 냉장 원심분리기 필요, Hot Phenol 방법보다 15배 더 비쌈</td>
			<td>고비용(Hot Phenol보다 72배 더 비쌈), 낮은 수율, 컬럼 막힘</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>장점</td>
			<td>적은 부피로 더 높은 수율 확보, 저비용, 세포 용해를 위한 비드 비터(beat beater) 불필요, 냉장 원심분리 불필요</td>
			<td>중간 정도의 수득률과 비용, 냉장 원심분리 필요</td>
			<td>수득률 보통, 매우 고가</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>주요 비용 요인</td>
			<td>일반 실험실 시약 (TES 완충액 성분, 산성 페놀, 클로로포름, 이소프로판올, 에탄올)</td>
			<td>시판 TRI Reagent®, 클로로포름 또는 클로로포름:이소아밀 알코올, 이소프로판올, 에탄올</td>
			<td>Qiagen 전용 스핀 컬럼 및 버퍼</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 무결성 지수(RIN)</td>
			<td>8-10 RIN</td>
			<td>7.5-10 RIN</td>
			<td>9-10 RIN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 3가지 서로 다른 RNA 추출 절차(Hot Phenol, TRIzol 및 RNeasy 방법)의 비용, 시간 및 제한 사항 비교.
보충 그림 1: RNA 추출 최적화. (A) 수동 조직 분쇄기를 이용한 용해 및 Hot Phenol을 사용한 RNA 추출. (B) TRIzol을 사용한 RNA 추출. (C) RNeasy 방법을 사용한 RNA 추출. (D) 다양한 방법으로 Msmeg에서 추출한 RNA 겔 이미지의 밀도 분석. 오차 막대는 GraphPad Prism을 사용하여 계산한 표준 오차를 나타냄(n = 8). (E) Mtb 균주에서 Hot Phenol을 사용한 RNA 추출. 모든 겔 사진은 독립적인 생물학적 반복 실험 결과임. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S1.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: (상단 패널) 다음의 용해 곡선 분석 결과: mysA, sigE, 및 sigH M. smeg 유래, n = 3; (하단 패널) RNA 무결성 분석. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69006/Figure%20S2.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 연구에서는 Mycobacterium을 위한 Hot Phenol 기반의 RNA 추출 방법을 최적화하여, 전사체 분석에 적합한 고품질의 RNA를 얻었습니다. 동일한 조건에서 TRIzol 및 RNeasy와 벤치마킹하여 비교한 결과, 본 방법은 더 높은 수율과 대등한 무결성, 그리고 향상된 비용 효율성을 보여주어 대규모 유전자 발현 연구를 위한 실용적인 대안을 제공합니다.

마이코박테리아로부터의 최적화된 핫 페놀 기반 RNA 추출: 신뢰할 수 있는 유전자 발현 분석을 위한 강력한 방법론

결핵균(*Mycobacterium tuberculosis*, Mtb)은 여전히 전 세계적으로 주요한 보건 위협이 되고 있으며, 이는 결핵균의 생물학적 특성을 이해하기 위한 신뢰할 수 있는 전사체 연구의 필요성을 강조합니다.

optimized-hot-phenolbased-rna-extraction-from-mycobacteria-robust

Research

연구

JoVE Journal

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에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Amity University Uttar Pradesh.  This study optimizes a Hot Phenol–based RNA extraction method for Mycobacterium, yielding high-quality RNA suitable for transcriptomic analyses. When benchmarked against TRIzol and RNeasy under identical conditions, the method provided higher yield, comparable integrity, and improved cost-efficiency, offering a practical alternative for large-scale gene expression studies.

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