게이트키퍼 시각화: 성인 제브라피쉬의 혈액-뇌 장벽 투과성에 대한 Evan의 파란색 염료 기반 평가

이 연구는 성인 제브라피쉬의 혈액-뇌 장벽 무결성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있고 간단하며 비용 효율적인 방법을 개발하는 데 중점을 둡니다. 대부분의 제브라피쉬 연구에는 혈액-뇌 장벽 파괴를 측정하는 쉽고 신뢰할 수 있는 방법이 없으며 기존 방법은 종종 복잡하거나 비용이 많이 듭니다. 따라서 이 프로토콜은 실용적이고 저렴한 솔루션을 제공합니다.

이 프로토콜은 간단하고 비용 효율적이며 시각적 분석과 측정 가능한 분석을 모두 결합하며, 값비싼 장비나 복잡한 단계가 필요하지 않습니다. 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 제공함으로써 실험실에서 성체 제브라피쉬 질병 모델에서 신경혈관 변화를 더 쉽게 탐색할 수 있습니다. 시작하려면 물고기가 더 이상 촉각 자극에 반응하지 않을 때까지 수온을 섭씨 12도에서 섭씨 7도로 점차적으로 낮추어 제브라피쉬를 마취합니다.

31게이지 인슐린 주사기를 사용하여 20마이크로리터의 1% 에반스 블루 또는 EB 염료를 물고기의 복강에 주입하고 주사 부위에 10초 동안 부드럽게 압력을 가하여 역류를 방지합니다. 이제 물고기를 회수 탱크로 옮기고 30분 동안 회수하십시오. 이 기간 동안 물고기의 부상, 사망률 또는 행동 변화를 모니터링하십시오.

양성 대조군을 설정하려면 인슐린 주사기에 부착된 멸균 31게이지 바늘을 준비하여 자상 부상 절차를 수행합니다. 30분의 회복 기간이 지나면 앞서 설명한 대로 물고기를 다시 마취합니다. 아이스 젤 팩과 같이 평평하고 차가운 표면에 물고기를 똑바로 세웁니다.

바늘을 두부의 한쪽에 90도 각도로 1.5mm를 초과하지 않는 깊이로 삽입합니다. 그런 다음 생선을 회수 탱크로 옮기고 30분 동안 회복시킵니다. 저체온증으로 물고기를 안락사시킨 후 멸균 칼날이나 수술용 가위를 사용하여 안락사된 물고기의 목을 베십시오.

과도한 혈액과 Evans 블루 염료를 제거하기 위해 생선과 PBS의 1:20 비율을 사용하여 1X PBS로 머리를 두 번 헹굽니다. 그런 다음 생선과 고정액의 1:20 비율을 사용하여 머리를 4% 파라포름알데히드에 고정하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 고정된 머리를 깨끗한 페트리 접시에 넣고 끝이 뾰족한 핀셋을 사용하여 뇌를 해부합니다.

해부 중에 PBS를 지속적으로 적방하여 조직에 수분을 유지하고 건조를 방지합니다. 해부된 뇌를 두 개의 별도 PBS 수조에서 두 번 헹구고 조직을 1% 아가로스 플레이트에 올려 수분을 유지하고 수축을 방지합니다. 해부된 뇌 조직을 실체 현미경으로 관찰합니다.

정량 분석을 시작하려면 피지 소프트웨어를 다운로드하여 설치하고 피지에서 뇌 이미지 파일을 엽니다. 이미지를 선택한 다음 색상, 색상 디콘볼루션을 차례로 선택하고 RGB를 선택하여 색상 디콘볼루션을 수행합니다. 이렇게 하면 빨간색, 녹색 및 파란색 색조를 나타내는 세 개의 개별 이미지가 생성됩니다.

이제 이미지를 클릭하여 일반적으로 색상 3으로 표시된 파란색 채널 이미지를 활성화합니다. 이미지를 선택한 다음 유형, 8비트를 선택하여 8비트 그레이스케일로 변환합니다. 다음으로, 8비트 이미지의 회색 강도를 측정하려면 분석 및 측정 설정을 선택하여 측정 매개변수를 설정합니다.

그런 다음 면적과 평균 회색 값을 선택합니다. 사각형 선택 도구를 사용하여 균일한 크기의 관심 영역을 그리고 분석을 선택한 다음 측정을 선택하여 회색 강도를 측정합니다. 일반 제브라피쉬는 전형적인 갈색을 띤 피부색을 보였고, EB를 주입한 제브라피쉬는 눈에 띄는 푸르스름한 색조를 보였습니다.

성체 제브라피쉬 파킨슨병 모델에서 혈액-뇌 장벽 무결성을 조사하기 위해 뇌 조직으로의 EB 염료 유출을 식염수 주입 대조군과 파킨슨병 제브라피쉬 사이에서 비교했습니다. 음성 대조군에서는 뇌의 혈관이 붉은색을 띠게 되어 EB 염료 유출이 없음을 나타냅니다. 대조적으로, 식염수 주사 대조군, 양성 대조군, 파킨슨병 그룹은 모두 뇌 맥管계에서 푸르스름한 착색을 보여 EB 염료의 성공적인 전신 순환을 확인했습니다.

음성 대조군에서 해부된 뇌는 혈관이 선명하게 보이는 희끄무레한 것으로 나타났으며 EB 염색이 없음을 확인했습니다. 양성 대조군 손상 그룹에서 뇌 조직을 둘러싼 강렬한 파란색은 고의적인 혈액-뇌 장벽 파괴로 인한 염료 누출을 나타냈습니다. 식염수 주입 그룹에서 EB 염색은 혈관에 국한되어 혈액-뇌 장벽이 온전함을 나타냅니다.

파킨슨병 그룹은 더 어둡고 확산된 파란색 염색 패턴을 보였으며, 이는 상당한 EB 염료 누출 및 혈액-뇌 장벽 손상을 나타냅니다. 정량적 그레이스케일 분석 결과 식염수 주입 그룹에 비해 파킨슨병 그룹에서 회색 강도 값이 유의하게 낮은 것으로 나타났습니다.