Name: NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 학습하세요 NgTET 효소를 활용한 CRISPR-Cas 시스템으로 박테리오파지 DNA 변형을 효율적으로 감소시키는 정확한 돌연변이 유발 방법을. 이 기술은 파지 치료와 생명공학 응용에 새로운 가능성을 열어줍니다.

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<ol><li>Pozhydaieva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+epigenome+modulation+enables+efficient+bacteriophage+engineering+and+functional+analysis+of+phage+DNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Temporal epigenome modulation enables efficient bacteriophage engineering and functional analysis of phage DNA modifications.</a> PLoS Genet. 20 (9), e1011384(2024).</li>
<li>Schroven, K., Aertsen, A., Lavigne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophages+as+drivers+of+bacterial+virulence+and+their+potential+for+biotechnological+exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacteriophages as drivers of bacterial virulence and their potential for biotechnological exploitation.</a> FEMS Microbiol Rev. 45 (1), fuaa041(2021).</li>
<li>Moye, Z. D., Woolston, J., Sulakvelidze, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+applications+for+food+production+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage applications for food production and processing.</a> Viruses. 10 (4), 205(2018).</li>
<li>Wolfram-Schauerte, M., Pozhydaieva, N., Viering, M., Glatter, T., Hofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+omics+reveal+time-resolved+insights+into+T4+phage+infection+of+E.+coli+on+proteome+and+transcriptome+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Integrated omics reveal time-resolved insights into T4 phage infection of E. coli on proteome and transcriptome levels.</a> Viruses. 14 (11), 2502(2022).</li>
<li>Usman, S. S., Uba, A. I., Christina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+genome+engineering+for+phage+therapy+to+combat+bacterial+antimicrobial+resistance+as+an+alternative+to+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage genome engineering for phage therapy to combat bacterial antimicrobial resistance as an alternative to antibiotics.</a> Mol Biol Rep. 50 (8), 7055-7067 (2023).</li>
<li>Vlot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+DNA+glucosylation+impairs+target+DNA+binding+by+type+I+and+II+but+not+by+type+V+CRISPR-Cas+effector+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage DNA glucosylation impairs target DNA binding by type I and II but not by type V CRISPR-Cas effector complexes.</a> Nucleic Acids Res. 46 (2), 873-885 (2018).</li>
<li>Tao, P., Wu, X., Tang, W. C., Zhu, J., Rao, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+bacteriophage+T4+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering of bacteriophage T4 genome using CRISPR-Cas9.</a> ACS Synth Biol. 6 (10), 1952-1961 (2017).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Zemach, A., McDaniel, I. E., Silva, P., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+evolutionary+analysis+of+eukaryotic+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation.</a> Science. 328 (5980), 916-919 (2010).</li>
<li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li>
<li>Shitrit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+marine+cyanophages+reveals+integration+but+not+lysogeny+in+T7-like+cyanophages%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of marine cyanophages reveals integration but not lysogeny in T7-like cyanophages.</a> ISME J. 16 (2), 488-499 (2022).</li>
<li>Dedrick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacteriophages+for+treatment+of+a+patient+with+a+disseminated+drug-resistant+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered bacteriophages for treatment of a patient with a disseminated drug-resistant Mycobacterium abscessus.</a> Nat Med. 25 (5), 730-733 (2019).</li>
<li>Marinelli, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRED%3A+a+simple+and+powerful+tool+for+constructing+mutant+and+recombinant+bacteriophage+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">BRED: a simple and powerful tool for constructing mutant and recombinant bacteriophage genomes.</a> PLoS One. 3 (12), e3957(2008).</li>
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<li>Pozhydaieva, N., Höfer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Golden+Gate+assembly+to+streamline+CRISPR-Cas%2FNgTET-based+phage+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Utilizing Golden Gate assembly to streamline CRISPR-Cas/NgTET-based phage mutagenesis.</a> Methods Mol Biol. 2850, 329-343 (2025).</li>
<li>Ramírez Rojas, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DuBA.Flow%E2%94%80a+low-cost%2C+long-read+amplicon+sequencing+workflow+for+the+validation+of+synthetic+DNA+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">DuBA.Flow─a low-cost, long-read amplicon sequencing workflow for the validation of synthetic DNA constructs.</a> ACS Synth Biol. 13 (2), 457-465 (2024).</li>
<li>Lagerbäck, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+T4+endonuclease+II%2C+a+promiscuous+GIY-YIG+nuclease%2C+binds+as+a+tetramer+to+two+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage T4 endonuclease II, a promiscuous GIY-YIG nuclease, binds as a tetramer to two DNA substrates.</a> Nucleic Acids Res. 37 (18), 6174-6183 (2009).</li>
<li>Lagerbäck, P., Carlson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+in+the+GIY-YIG+endonuclease+II+of+phage+T4+affecting+sequence+recognition+and+binding+as+well+as+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues in the GIY-YIG endonuclease II of phage T4 affecting sequence recognition and binding as well as catalysis.</a> J Bacteriol. 190 (16), 5533-5544 (2008).</li>
<li>Shembrey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+CRISPR-Cas13+mismatch+intolerance+enable+selective+silencing+of+point-mutated+oncogenic+RNA+with+single-base+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Principles of CRISPR-Cas13 mismatch intolerance enable selective silencing of point-mutated oncogenic RNA with single-base precision.</a> Sci Adv. 10 (51), eadl0731(2024).</li>
<li>Molina Vargas, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+design+strategies+for+ultra-specific+CRISPR-Cas13a-based+RNA+detection+with+single-nucleotide+mismatch+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">New design strategies for ultra-specific CRISPR-Cas13a-based RNA detection with single-nucleotide mismatch sensitivity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (2), 921-939 (2024).</li>
<li>Shi, P., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+targeting+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA targeting with CRISPR-Cas13.</a> RNA Biol. 21 (1), 1-9 (2024).</li>
<li>Levin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+and+evolutionary+dynamics+of+phage+and+bacteria+with+CRISPR-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The population and evolutionary dynamics of phage and bacteria with CRISPR-mediated immunity.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003312(2013).</li>
<li>Hershey, A. D., Chase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+functions+of+viral+protein+and+nucleic+acid+in+growth+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage.</a> J Gen Physiol. 36, 39-56 (1952).</li>
<li>Bair, C. L., Rifat, D., Black, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusion+of+glucosyl-hydroxymethylcytosine+DNA+containing+bacteriophages+is+overcome+by+the+injected+protein+inhibitor+IPI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Exclusion of glucosyl-hydroxymethylcytosine DNA containing bacteriophages is overcome by the injected protein inhibitor IPI.</a> J Mol Biol. 366 (3), 779-789 (2007).</li>
</ol>

박테리오파지는 박테리아를 특이적으로 표적으로 삼는 바이러스입니다. 그들은 생명공학 및 의학, 특히 다제내성 박테리아와의 싸움에서 엄청난 잠재력으로 인해 상당한 연구 관심을 끌었습니다 1,2,3. 그럼에도 불구하고 파지 생물학은 상대적으로 연구가 부족합니다. 박테리아 숙주를 납치하는 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해는 치료 및 생명 공학 잠재력을 완전히 활용하는 데 필수적입니다4. 효율적인 파지 감염의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하고 특정 응용 분야를 위해 파지를 조작하려면 파지 게놈을 유전적으로 변형하는 능력이 필수적입니다. 그러나 이는 파지 생물학 분야에서 가장 중요한 과제 중 하나로 남아 있습니다 3,5,6.
파지 DNA는 종종 퓨린 및 피리미딘 염기의 특정 화학적 변화, 예를 들어 시토신 글리코실화 및 메틸화에 의해 변형됩니다. 이러한 변형은 숙주 뉴클레아제에 의한 인식 및 분해로부터 파지 유전 물질을 보호합니다6. 이러한 변형은 파지 적합성에 중요하지만 DNA 표적 시스템에 의존하는 파지 게놈 공학 접근법에 중요한 장애물입니다 2,3,7.
제한 변형 시스템 및 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CRISPR 관련(Cas) 단백질 기반 기술을 포함한 기존 돌연변이 유발 전략은 시토신 글리코실화와 같은 보호적 후생유전학적 변형으로 인해 파지 DNA를 변형할 때 심각한 문제에 직면해 있습니다8. 박테리아 및 진핵 세포에서 매우 효과적인 CRISPR-Cas 매개 게놈 편집은 Cas 뉴클레아제에 의한 표적 게놈 유전자좌에서 DNA의 정확한 절단에 이어 원하는 돌연변이를 운반하는 기증자 DNA와의 상동 재조합을 통한 DNA 복구라는 두 가지 주요 단계에 의존합니다1. 그러나 파지에서 DNA 변형은 종종 Cas 뉴클레아제가 게놈에 효율적으로 결합하거나 절단하는 것을 방해합니다. 또한, 파지 복제의 빠르고 일시적인 특성은 상동 재조합의 효율성을 더욱 제한할 수 있습니다. 이러한 장벽으로 인해 파지 돌연변이 유발을 위해 DNA 표적 CRISPR-Cas 기술을 적용하는 것이 특히 어렵습니다. 파지 DNA 변형은 시험관 내 및 생체 내 CRISPR-Cas로 파지 DNA 표적화를 손상시키는 것으로 나타났습니다 6,7.
파지의 보호 DNA 변형으로 인한 문제를 해결하기 위해 우리는 TET(ten-eleven translocation) 메틸시토신 디옥시게나제, 특히 NgTET의 활성을 활용하는 게놈 돌연변이 유발 전략을 도입합니다. 진핵생물에서 TET 효소는 반복적인 과정을 통해 메틸화된 시토신의 단계적 산화를 촉매합니다: 메틸시토신(5mdC)은 먼저 하이드록시메틸시토신(5hmdC)으로 전환된 다음 포르밀시토신(5fdC), 마지막으로 카르복시시토신(5cadC)으로 전환됩니다(그림 1).
당사의 파지 돌연변이 유발 접근법에서 NgTET는 보호 DNA 변형의 풍부함을 일시적으로 감소시키는 데 사용되어 Cas 효소와 같은 게놈 편집 도구에 대한 파지 DNA의 접근성을향상시킵니다 9. NgTET는 이종 박테리아 숙주, 특히 대 장균에서 활성 가용성 형태로 성공적으로 발현되었다는 이전 보고로 인해 박테리오파지 게놈을 조절하기 위해 선택되었습니다. NgTET는 파지 감염 동안 활성 상태를 유지해야 하므로 이 특성은 필수적입니다10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69022/69022fig1v2.jpg"> 
그림 1: TET Dioxygenase1에 의한 5-메틸시토신의 단계적 산화. TET 디옥시게나제는 5-메틸-2'-데옥시시티딘(5mdC)의 연속적인 산화를 촉매하여 5hmdC, 5-포르밀-2'-데옥시시티딘(5fdC), 궁극적으로 5-카르복실-2'-데옥시시티딘(5cadC)으로 산화합니다. 최종 산물인 5cadC는 자발적으로 또는 효소적으로 변형되지 않은 시토신(dC)으로 되돌아가 동적 후생유전학적 조절에 기여합니다. 이 다단계 과정은 진핵생물에서 활성 DNA 메틸화의 핵심입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69022/69022fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
메틸시토신과 하이드록시메틸시토신은 글리코실화와 같은 부피가 큰 보호 구조를 포함하여 파지 DNA 과변형의 일반적인 전구체이기 때문에 TET 디옥시게나제의 산화 활성을 이용하여 이러한 DNA 과변형의 형성을 방지할 수 있습니다9. 이 TET 기반 게놈 돌연변이 유발 접근법에서는 대장균에서 NgTET를 이종적으로 재조합하여 감염 시 파지 게놈의 하이드록시메틸화 시토신을 산화시켜 부피가 큰 글리코실화의 형성을 방지합니다. 이러한 부피가 큰 DNA 변형의 풍부함을 줄임으로써 우리의 접근 방식은 CRISPR-Cas 뉴클레아제에 대한 파지 DNA 접근성을 높일 수 있습니다. 이러한 향상된 접근성은 효율적인 표적 인식, 정확한 DNA 절단 및 파지 게놈에 흉터 없는 점 돌연변이를 도입하여 유전자 결실, 리포터 유전자 삽입 또는 PCR 기반 돌연변이 선택을 위한 인공 접합의 통합에 의존하는 전통적인 파지 돌연변이 유발 방법과 구별됩니다 1,11. 이러한 기존 전략은 지금까지 파지 게놈에서 표적 돌연변이 유발을 위해 사용할 수 있는 유일한 도구였으므로 여기에 제시된 방법의 중요한 기초를 나타냅니다. 그러나 단일 파지 단백질은 여러 기능을 가질 수 있습니다. 관심 단백질을 암호화하는 전체 유전자의 결실은 모든 관련 기능을 방해합니다. 대조적으로, 점 돌연변이의 표적 도입은 특정 기능의 선택적 비활성화를 허용하여 그 역할에 대한 자세한 분석을 가능하게 합니다. 현재까지 많은 파지 단백질의 기능은 거의 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 따라서 주어진 유전자와 관련된 추가 활동을 간과할 수 있습니다. 따라서 전체 단백질에 최소한의 변화를 일으키면서 단일 기능만 제거하는 것을 목표로 하는 최소한의 접근법이 바람직하다12,13. 여기에 설명된 방법은 전체 게놈 조직이나 기능을 방해하지 않고 정확한 유전자 변형을 가능하게 합니다. 이전 파지 돌연변이 유발 방법의 또 다른 주요 과제는 일반적으로 약 0.1%의 돌연변이율을 산출하는 낮은 효율성이었습니다1,11. 이 기술을 통해 우리는 단일 코돈 변화를 도입할 수 있는 최초의 돌연변이 유발 전략을 제시하여 표적 효율성의 눈에 띄는 7배 증가를 달성합니다. ONT 기반 고처리량 스크리닝 방법과 결합하면 점 돌연변이 검출이 단순화되어 하나의 돌연변이를 분리하기 위해 대규모 파지 집단을 스크리닝할 필요가 없습니다. 여기에 설명된 TET 기반 돌연변이 유발 전략은 현장의 오랜 한계를 해결하고 보다 신뢰할 수 있는 게놈 편집을 가능하게 합니다14.
전반적으로 이 방법은 박테리오파지 감염 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 적용될 뿐만 아니라 합성 생물학에도 상당한 가능성을 가지고 있습니다. 정확하고 효율적인 파지 게놈 엔지니어링을 가능하게 함으로써 파지를 특정 응용 분야에 맞게 조정할 수 있는 길을 열어 생명공학 및 의료 응용 분야의 잠재력을 향상시킵니다.

<table><tbody><tr><td>1.5mL 반응 튜브</td><td>사르슈테트</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 카노셜 튜브</td><td>사르슈테트</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 개방형 얇은 벽 폴리프로필렌 튜브</td><td>Beckman Coulter 생명 과학</td><td>361706</td><td>16 mm x 95 mm (초원심분리용)</td></tr><tr><td>50mL 표준 튜브</td><td>사르슈테트</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>5x GC 버퍼</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>F519엘</td><td></td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA 로딩 염료&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>R1161</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>메리디안 바이오사이언스</td><td>바이오-41025</td><td>분자 등급</td></tr><tr><td>Avanti J-30I 원심분리기</td><td>Beckman Coulter 생명 과학</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>세리엔-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe</td></tr><tr><td>붕산&nbsp;</td><td>머 크</td><td>10043-35-3</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF v2</td><td>NEB</td><td>R3733S</td><td></td></tr><tr><td>칼슘염소 헥사히드랏</td><td>아크로스 오가닉스</td><td>7774-34-7</td><td>97 %, 엑스트라 퓨어&nbsp;</td></tr><tr><td>세포 밀도계</td><td>하버드 바이오크롬&nbsp;</td><td>80211630</td><td></td></tr><tr><td>케미독 MP&nbsp;</td><td>바이오라드</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>VWR</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>큐 벳</td><td>사르슈테트</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>인산수소이나트륨</td><td>네오프록스 GmbH</td><td>7558-79-4</td><td>제약 등급</td></tr><tr><td>일회용 유리 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>230 밀리미터</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>로슈</td><td>4716728001</td><td>10 U/&마이크로; L</td></tr><tr><td>dNTP 혼합물(각 dNTP 10mM)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>DS_SPcas_ModA</td><td>사내 제품.</td><td>https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_maps</td><td>CRISPR-Cas12/ModA sgRNA를 포함하는 플라스미드 구축물</td></tr><tr><td>DS-spCas(CRISPR-Cas9 시스템)</td><td>Addgene&nbsp;</td><td>48645 (addgene 액세서리 번호)</td><td>파지 돌연변이 유발을 위한 스페이서 함유 CRISPR-Cas 플라스미드(CRISPR-Cas9 시스템) 구축을 위한 플라스미드(단계 3.2)</td></tr><tr><td>대장균 B 균주는 T4 감염에 사용되었습니다.</td><td>DSMZ</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>대장균 (Migula 1895) Castellani 및 Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)</td></tr><tr><td>대장균 BL21 (DE3) 발현 균주, 유능한 세포</td><td>인비트로젠</td><td>C600003</td><td>발현 균주, 유능한 세포.</td></tr><tr><td>대장균 DH5&알파; 복제 균주, 유능 세포</td><td>인비트로젠</td><td>18265017</td><td>복제 균주, 유능한 세포.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>로스</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(절대)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>200-578-6</td><td></td></tr><tr><td>Flongle 플로우 셀</td><td>옥스포드 나노포어 기술</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>R10.4.1. 화학, https://nanoporetech.com/document/flongle</td></tr><tr><td>유전자 JET 플라스미드 미니프렙 키트&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>10242490</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA 래더</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>에스엠1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler ULR DNA 사다리&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>SM1213</td><td></td></tr><tr><td>그라디언트 마스터 108</td><td>바이오콤프</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming</td></tr><tr><td>Heraeus Pico 17 원심분리기</td><td>써모 사이언티픽</td><td>75002410</td><td></td></tr><tr><td>인포어 HT 인큐베이터 미니트론</td><td>인포스 AG</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs</td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)</td><td>시그마-알드리치</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>칼 로스</td><td>T832.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-한천</td><td>칼 로스</td><td>엑스969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB-medium(루리아/밀러)&nbsp;</td><td>칼 로스</td><td>엑스968.1</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>MinION 장치&nbsp;</td><td>Oxfrod 나노포어 기술</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html</td></tr><tr><td>ModA E165A_fw</td><td>IDT</td><td>GAATTAGTTTCAGATGA ACAAGCGGTAATGATAC CAGCT</td><td>ModA E165A에 대한 점 돌연변이 도입 및 골든 게이트 복제를 위한 끈적끈적한 말단 도입을 위한 포워드 프라이머(3.1단계)</td></tr><tr><td>ModA E165A_rev</td><td>IDT</td><td>CATATTACGATAACGA TGACTATCCGGAAAC</td><td>ModA E165A에 대한 점 돌연변이 도입 및 Golden Gate 복제를 위한 끈적끈적한 말단 도입을 위한 역방향 프라이머(3.1단계)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_fw</td><td>IDT</td><td>TCTTGTTCATCTACAAC AGTAGAAATTAATTTAAA GTTCTTAGACCCG</td><td>파지 돌연변이 유발 및 역선택을 위한 CRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13 시스템용 스페이서 생성을 위한 포워드 프라이머(단계 3.2 및 단계 4.1)</td></tr><tr><td>ModA_sgRNA_Cas12_rev</td><td>IDT</td><td>AGTAATGATAAAGAACT TTAAATAATTTCTACTGT TGTAGATGCTAC</td><td>파지 돌연변이 유발 및 반대 선택을 위한 CRISPR-Cas12/ CRISPR-Cas9/ CRISPR-Cas13 시스템용 스페이서 생성을 위한 역방향 프라이머(3.2단계 및 4.1단계)</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 분광 광도계&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>AZY2019944</td><td></td></tr><tr><td>NucleoMag 키트&nbsp;</td><td>마셰리 나겔</td><td>참조 번호 744970.50</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오시드 소화 혼합물&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0649S</td><td></td></tr><tr><td>pBA560 (CRISPR-Cas13 시스템)</td><td>아드진</td><td>186236(addgene 액세서리 번호)</td><td>카운터 셀렉션을 위한 CRISPR-Cas13 시스템을 인코딩하는 플라스미드(단계 4.1)</td></tr><tr><td>pCpfl-sp 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템)</td><td>아드진</td><td>122186</td><td></td></tr><tr><td>pCpfl-sp 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템)</td><td>아드진</td><td>122186(addgene 액세서리 번호)</td><td>파지 돌연변이 유발을 위한 스페이서 함유 CRISPR-Cas 플라스미드(CRISPR-Cas12 시스템) 구축을 위한 플라스미드(단계 3.2)</td></tr><tr><td>PCR 반응 용기</td><td>사르슈테트</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>펙그린</td><td>VWR</td><td>732-3196</td><td></td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>사내 제품.</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>플라스미드는 요청 시 사용할 수 있으며 플라스미드 맵은 다음 https://zenodo.org/records/10615143&nbsp 에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>pET28a_NgTET&nbsp;</td><td>사내 제품.</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>Golden Gate Cloning(단계 3.1)을 통한 pET28a_NgTET_donor DNA 구축을 위한 플라스미드, 플라스미드&nbsp; 요청 시 사용할 수 있으며, 플라스미드 맵은 다음 https://zenodo.org/records/10615143&nbsp 에서 찾을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>사르슈테트</td><td>82.1473.001</td><td>92 x 16 mm(캠 포함)</td></tr><tr><td>Phusion DNA 중합효소&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>F-530XL</td><td>2 U/&마이크로; L</td></tr><tr><td>인산칼륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>7778-77-0</td><td>단염기성</td></tr><tr><td>PowerPac 범용 전원 공급 장치</td><td>바이오 래드</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>프로테이나제 K&nbsp;</td><td>칼 로스&nbsp;</td><td>7528.1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트&nbsp;</td><td>키아겐</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Quantus 형광계, QuantiFluor dsDNA 시스템</td><td>프로메가</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>RNase A/T1&nbsp;</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>EN0551 인증</td><td>RNase A 2mg/mL 5000 U/mL RNase T1&nbsp 혼합;</td></tr><tr><td>DNA 추출을 위한 Roti-Aqua P/C/I&nbsp;</td><td>칼 로스</td><td>엑스985.1</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>SQK-LSK109 결찰 시퀀싱 키트</td><td>옥스포드 나노포어 기술</td><td>카탈로그 없음&nbsp; 수</td><td>https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109</td></tr><tr><td>Steritop 필터, 0.22 및 마이크로; M 기공 크기</td><td>밀리포어</td><td>S2GPT05RE</td><td>250mL 및 500mL</td></tr><tr><td>스트렙토마이신 50 mg/L</td><td>칼 로스</td><td>HP66.1</td><td></td></tr><tr><td>자당류</td><td>네오프록스 GmbH</td><td>57-50-1</td><td>분자 생물학&NBSP;</td></tr><tr><td>스윙 버킷 알루미늄 로터&nbsp;</td><td>Beckman Coulter 생명 과학</td><td>JS[1]24.15</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제 5 U/&micro; L</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>엘0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제 완충액</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>B69</td><td></td></tr><tr><td>시험관, 두꺼운 벽, 테두리가 없는</td><td>칼 헤흐트 GmbH</td><td>42775054</td><td>100mm x 18mm</td></tr><tr><td>열 순환기, T100</td><td>바이오라드</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>열믹서 편안함&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 베이스</td><td>시그마 알드리치</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>수욕, VWB2&nbsp;</td><td>VWR</td><td>462-0557</td><td>12L 용량</td></tr></tbody></table>

ngtet 지원 crispr-cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

Precise Phage Mutagenesis with NgTET-Assisted CRISPR-Cas Systems

구배에서 파지 밴드의 식별. 그래디언트에서 파지 밴드의 가시성은 그래디언트에 로드된 초기 샘플의 파지 농도에 따라 달라집니다. 파지가 충분히 농축되면(~&gt;1 × 1011 PFU/mL), 광원으로 바닥에서 기울기를 비추면 밴드를 명확하게 볼 수 있습니다( 그림 3 참조).
그러나 파지 농도가 낮으면 밴드가 쉽게 보이지 않을 수 있습니다. 이 경우 파지를 검출할 수 있는 어둠 속에서 아래에서 튜브를 비추어 시각화 시도를 반복하는 것이 좋습니다.
파지 밴드가 여전히 보이지 않으면 무딘 캐뉼라를 사용하여 상단에서 구배 분획을 조심스럽게 제거하고 분획당 1.5mL를 수집합니다. 그런 다음 이러한 분획을 플라크 분석을 통해 분석하여 파지 농도를 결정할 수 있습니다. 파지 농도가 가장 높은 두 분획은 후속 DNA 추출을 위해 결합...

NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

Bacteriophages, viruses that specifically target their bacterial hosts, hold significant potential for biotechnology and medicine, especially in combating ...

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

여기, 우리 CRISPR-Cas9-대상 활동의 손실 없이 더 높은 특이성을 달성 하기 위해 최적화 하는 프로토콜을 제시. 우리는 원하는 특성을 가진 돌연변이 Cas9를 찾을 수 라고 스나이퍼-화면 감독된 진화 접근을 사용 합니다. 스나이퍼-Cas9와 잘린된 단일 가이드 RNAs는 ribonucleoprotein 형태로 배달 높은 특이성을 달성 하기 위한 잘 알려진 전략 이다.

스나이퍼-Cas9를 사용 하 여 대상에서 감독된 진화를 통해 대상에 활동의 손실 없이 CRISPR Cas9의 영향을 최소화 하

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 연구는 동형접합 메뚜기 돌연변이의 CRISPR/Cas9 리보뉴클레아제 기반 구성의 체계적으로 최적화된 절차와 메뚜기 알의 냉동 보존 및 소생을 위한 상세한 방법을 제공합니다.

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

학습하세요 NgTET 효소를 활용한 CRISPR-Cas 시스템으로 박테리오파지 DNA 변형을 효율적으로 감소시키는 정확한 돌연변이 유발 방법을. 이 기술은 파지 치료와 생명공학 응용에 새로운 가능성을 열어줍니다.

NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

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