NgTET 지원 CRISPR-Cas 시스템을 사용한 정확한 파지 돌연변이 유발

우리는 분자 수준에서 파지 감염을 연구합니다. 이것은 정말 기초 과학입니다. 그러나 우리는 기초 과학을 할 뿐만 아니라 이 기초 과학을 파지 감염을 연구하는 데 사용하고 이를 파지 공학 및 치료 응용 분야에 사용하는 응용 프로그램으로 전환하고 싶습니다.

파지 연구 분야의 가장 최근 발전 중 하나는 박테리아 면역 체계의 발견입니다. 이 면역 체계는 모든 박테리아에 존재하며 파지와 실제로 싸울 수 있는 도구를 식별하거나 생성합니다. 그러나 파지는 매우 영리합니다.

파지는 도구를 식별하고 이러한 면역 체계에서 벗어날 수 있는 도구를 개발할 수 있었습니다. 그리고 한 가지 도구는 실제로 변형을 통해 DNA를 변형하는 것입니다. 그리고 이것은 특히 우리에게 정말 흥미롭고, 왜냐하면 파지가 면역 체계를 탈출하기 위해 생성한 이러한 DNA 변형의 화학적 특성을 연구하는 것은 정말 흥미롭고, 또한 우리가 결국 파지를 조작하는 도구가 될 수 있게 해주기 때문입니다.

지난 10년 동안 전 세계의 훌륭한 동료들에 의해 훌륭한 기술이 개발되었습니다. 이러한 기술 중 하나는 예를 들어 차세대 염기서열 분석입니다. 이 기술을 기반으로 우리는 실제로 파지뿐만 아니라 분자 수준에서 전체 숙주 게놈의 시퀀싱도 할 수 있습니다.

반면에 질량 분석법, 단백질체학과 같은 것이 개발되었습니다. CRISPR은 현재 다양한 생명의 왕국에 적용되는 훌륭한 도구입니다. 그리고 우리는 지금 이것을 파지 게놈을 조작하는 데 사용하고 있습니다.

이는 오늘날 파지에 대한 우리의 생각을 바꾼 몇 가지 놀라운 기술에 불과합니다. 현재의 과제에 대해 이야기할 때 우리가 보는 과제 중 하나는 파지 게놈의 엔지니어링 바이오 CRISPR입니다. 파지 게놈은 DNA 변형으로 완전히 변형되며 CRISPR 핵 ACE는 실제로 DNA를 절단할 수 없습니다.

따라서 이것은 박테리아 파지의 게놈을 조작하려면 극복해야 할 과제입니다. 우리 그룹은 RNA의 완전히 새로운 구성 요소를 발견했습니다. 우리는 특정 전사체가 소위 산화환원 유령, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 짧은 NAD라고 불리는 5개의 주요 말단에서 운반한다는 것을 발견했으며, 최근 대장균 T4 파지 상호작용에서 처음으로 이를 발견했습니다.

이 발견을 바탕으로 우리는 RNA와 단백질이 완전히 새로운 방식으로 서로 상호 작용할 수 있음을 확인했습니다. 우리는 이전에 설명한 이 NAD가 RNA와 단백질을 서로 연결하는 분자 접착제처럼 작동한다는 것을 발견했습니다. 이 RNA 의기양양은 RNA와 단백질이 자연에서 서로 상호 작용하는 방식에 대한 완전히 새로운 방법입니다.

그리고 우리는 에코 항파지 상호작용에서 이러한 발견을 했습니다. 우리는 또한 이제 이 기초 과학을 RNA 기반 치료제 분야와 같은 응용 분야로 전환하는 데 열중하고 있습니다. 시작하려면 500마이크로리터의 파지 현탁액을 20단위의 DNA 1로 처리합니다.

혼합된 2마이크로리터의 RNA AT1을 튜브에 추가합니다. 처리된 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 준비된 자당 구배 위에 처리된 파지 용액 500마이크로리터를 로드합니다.

섭씨 4도에서 20분 동안 70, 000G에서 구배를 원심분리합니다. 바닥에서 원심분리 튜브에 불을 붙여 그라디언트에서 탁한 파지 밴드를 시각화합니다. 그런 다음 무딘 캐뉼라를 사용하여 파지를 포함하는 분획을 새로운 초초원심분리 튜브로 조심스럽게 제거합니다.

이제 30밀리리터의 얼음처럼 차가운 TM 완충액을 튜브에 넣고 원심분리합니다. 그런 다음 상청액을 버린 후 500마이크로리터의 TM 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 재현탁된 파지를 밤새 섭씨 4도의 유리 바이알에 보관합니다.

재현탁된 파지에 1마이크로그램의 프로테이나제 K를 첨가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 같은 부피의 페놀 클로로포름, 이소아밀 알코올 혼합물을 샘플에 첨가합니다.

잘 섞기 위해 뒤집고 원심분리합니다. 수성상을 새 반응 튜브로 옮기고 추출을 세 번 반복합니다. 잔류 페놀을 제거하기 위해 동일한 부피의 클로로포름을 사용하여 세 번의 클로로포름 역추출을 수행합니다.

그런 다음 PH 5.5에서 0.1부피의 3몰 아세트산나트륨과 2.5부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킵니다. 혼합물을 섭씨 영하 20도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 15, 000G에서 원심분리하여 DNA를 펠릿화합니다.

DNA 펠릿을 200마이크로리터의 70% 에탄올로 두 번 세척합니다. 튜브를 부드럽게 흔들고 다시 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 소제, 정제된 DNA를 초순수에 현탁시킵니다. 추가 사용할 때까지 DNA를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. PET 28 NGTet 플라스미드와 CAS 12 또는 CAS 9 발현 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL 21D 3 세포를 접종합니다.

적절한 항생제를 보충한 LB 배지에서 교습하면서 섭씨 37도에서 배양액을 성장시킵니다. 0.05밀리몰 IPTG를 첨가하여 NG TED 발현을 유도하고 섭씨 37도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다. 대조군으로서, NgTET 과발현 유무에 따른 대장균 BL 21 D3 균주를 비교합니다.

300마이크로리터의 대장균 배양균을 멸균 튜브로 옮깁니다. T4 야생형 또는 NgTET 처리된 파지로 0.01의 감염 다중도에서 배양물을 감염시킵니다. 파지 분포가 균일하도록 부드럽게 혼합한 다음 다시 배양합니다.

박테리아 파지 혼합물을 0.75% 오거와 항생제를 함유한 LB 소프트 오거 4밀리리터에 첨가합니다. 거품이 생기지 않도록 철저히 섞되 부드럽게 섞으십시오. 부드러운 오거 혼합물을 예열된 LB 오거 플레이트에 붓습니다.

플레이트를 실온에서 잠시 응고시키고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 플라크를 세어 플라크 형성 단위의 수를 결정합니다. 카운터 선택을 위해 대장균 캐스트 13 A 스페이서를 감염시키십시오.

돌연변이 유발에 사용된 것과 동일한 조건에서 카운터 선택을 수행합니다. 배양 후 0.45마이크로미터 필터를 통해 SUP 내분제를 여과하여 박테리아 파편을 제거합니다. 대장균 B 균주에 대한 플라크 분석을 위해 카운터 선택 및 필터링된 파지를 사용하여 다운스트림 검증을 위해 개별 플라크를 분리합니다.

파지 밴드는 T4 파지 샘플이 충분히 농축되었을 때 명확하게 보였습니다. 대장균에서 NgTET 단백질의 발현은 세포 용해 및 원심분리 후 가용성 및 불용성 분획 모두에서 존재함을 나타내는 SDS 파지에 의해 확인되었습니다. 크로마토그램은 디옥시아데노신, 디요오도하이드록시퀴놀린 및 티미딘의 상대적 풍부도가 야생형과 NgTET 처리된 T4 파지 DNA 간에 변하지 않은 것으로 나타났습니다.

변형된 시토신 유도체의 풍부함은 처리되지 않은 샘플에 비해 NgTET 처리된 파지 DNA에서 유의하게 감소했습니다. NgTET 유전자를 포함하는 플라스미드와 표적 돌연변이 유발을 위한 상동성 영역을 골든 게이트 클로닝을 사용하여 구축했습니다. PCR 스크리닝은 agros gel의 레인 2에서 9까지 표적 유전자 암말의 성공적인 증폭을 확인했으며, 이는 선택된 플라크 중 양성 적중을 나타냅니다.

야생형 T4 파지 DNA에서 5 글리코실하이드록시에틸 2 프라임 데옥시딘의 상대적 풍부도가 높았습니다. NgTET 처리된 T4 파지 DNA에서 5 글리코실하이드록시에틸 2 프라임 데옥시딘의 수준은 야생형에 비해 크게 감소했습니다. 촉매 비활성 돌연변이 NgTET D234 A로 처리된 T4 파지 DNA는 높은 수준의 5 글리콜하이드록시에틸 2 프라임 데옥시딘을 유지했습니다.

회수된 T 4 파지 자손은 야생형에 비해 5 하이드록시메틸 2 프라임 데옥시딘 수치가 거의 회복된 것으로 나타났습니다.