고처리량 형식을 이용한 미생물 2차 대사산물에 대한 잎 반응 평가

저희 연구실은 식물 미생물과의 상호작용을 연구하며, 궁극적인 목표는 유전학을 이용해 물개 작물 저항성을 향상시키는 것입니다. 최근 발전은 미생물 2차 대사산물이 식물의 감수성 또는 저항성 촉진에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 우선, 지름 4밀리미터의 코르크 보어를 사용해 식물당 세 개의 잎 원반을 채취하고, 중간 정맥은 피하세요.

날카로운 끝으로 조직이 절개되는 것을 막기 위해 비틀어 주시기 바랍니다. 96웰 플레이트의 개별 웰에 원하는 농도의 2차 대사물이나 용매 처리를 추가하여 최종 부피인 200마이크로리터를 달성합니다. 잎 원반을 조심스럽게 웰에 넣으세요.

뚜껑을 제거한 96웰 플레이트를 진공 노즐이 장착된 벨자에 넣으세요. 그 다음 진공 호스를 벨 자르 노즐에 연결하고 9.8 파운드당 제곱인치의 진공 압력으로 10초간 작동시킵니다. 진공을 끄고 10초에 걸쳐 천천히 압력을 해제한 후 진공 사이클을 반복하세요.

이제 뚜껑을 96웰 플레이트 위에 다시 올리고, 광원 아래에서 궤도 셰이커 위에서 배양하세요. 셰이커 위 23센티미터 위치에서 4시간 동안 위치. 프로브를 초순수수에 씻고 보풀 없는 물티슈에 가볍게 두드려 말리세요.

향후 참고를 위해 물의 전도도 측정값도 주목하세요. 처리 후 4시간에서 6시간 사이에 잎 원반 주변 액체에 프로브를 담그고 개별 웰의 전도도를 측정하고 기록합니다. 프로브가 완전히 잠기도록 플레이트를 45도 각도로 유지하세요.

앞서 시연된 프로브 세척 후에는 때때로 물의 전도도를 테스트하여 프로브 안정성을 확인합니다. 그 후 96웰 플레이트 위에 플라스틱 천장 필름을 덮고 다시 궤도 셰이커로 보내 하룻밤 배큐를 합니다. 과산화효소 기질을 준비하기 위해, 교반이 있는 비커에서 증류된 멸균수 40밀리리터를 70도까지 가열합니다.

50밀리그램의 5가지 아미노 살리실산 액체를 가열한 물에 녹입니다. 그 후 물을 추가하여 전체 부피를 50밀리리터로 만들고, 수산화나트륨을 사용해 pH를 6으로 조절합니다. 빛에 민감한 용액은 알루미늄 호일로 용기를 덮어 보호하세요.

50밀리리터 호박색 원뿔 튜브에 1% 과산화수소 용액을 초순수에 담아 준비합니다. 그 다음, 분석 배지를 생성하는 데 필요한 5개의 아미노 살리실산 용액 1밀리리터당 10마이크로리터의 1% 과산화수소 용액을 첨가합니다. 원하는 시점에 다섯 번 혼합한 후, 샘플 플레이트의 각 웰에서 50마이크로리터를 새로운 플레이트로 옮깁니다.

검사액 50마이크로리터를 추가하고 실온에서 3분간 배양합니다. 반응을 멈추려면 각 웰에 20마이크로리터의 일반 수산화나트륨 2개를 추가하고, 플레이트 리더를 사용해 595나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 물과 0.1% 디메틸 설폭화물도 유사한 이온 누출과 과산화효소 활성 수준을 보여 음성 대조군으로서 사용이 입증되었습니다.

1미세몰 FLG 22 치료는 이온 누출, 과산화효소 활성, 칼로스 생성을 유의미하게 유도하여 강력한 양성 대조군임을 확인하였습니다. 그라밀린 처리는 상당한 이온 누출과 칼로스 생성을 유도했으나, 과산화효소 활성에 미치는 영향은 다양했다. 10마이크로몰 서파틴은 과산화효소 활성과 칼로스 생성을 모두 유도했으며, 이온 누출은 변하지 않았습니다.

T-2 독소 치료는 과산화효소 활성을 억제하면서도 칼로스 생성을 유도하고 이온 누출에는 영향을 미치지 않았습니다. 우리의 수중 분석법은 연구자들이 한 샘플에서 세 가지 서로 다른 스트레스 반응을 샘플링할 수 있게 해주며, 제한된 양의 미생물 2차 대사산물을 최대한 활용할 수 있게 합니다. 동일한 판에서 96개의 샘플을 비교할 수 있는 능력은 연구자들이 식물 미생물 간 상호작용을 이해하기 위해 집단 유전학 수준 스크리닝이나 시스템 생물학을 수행할 수 있게 합니다.

저의 연구는 식물 미생물과의 상호작용과 곡물 작물에서 질병 저항성 개발을 위해 활용할 수 있는 식물 유전자를 특성화하는 데 계속 집중할 것입니다.