염색질 및 후생유전학적 노화의 영상 기반 바이오마커를 이용한 단일 세포 노화 측정

우리는 단일 세포 해상도로 노화와 재생을 정량화하기 위해 고안된 새로운 기법인 영상 기반 염색질 및 후생유전적 연령 이미지를 개발했습니다. DNA 메틸화 시계는 생물학적 나이를 추정하지만, 선형 회귀에 의존하고 대규모 코호트가 필요하며 샘플을 파괴하여 비용이 많이 들고 대규모 또는 종단 연구에 적합하지 않습니다. 먼저, 얼린 장기와 조직을 미리 냉각된 모르타르에 옮기고, 그 위에 드라이아이스 위에 올려놓습니다.

액체 질소를 얼린 조직 위에 부은 뒤, 미리 냉각된 공으로 꼼꼼히 갈아 균일하게 미세한 가루가 나올 때까지 합니다. 미리 냉각된 금속 주걱을 사용해 분쇄 조직을 여러 개의 관으로 나누어 나눕니다. 핵을 추출한 후, 별도의 튜브에서 트리판 블루와 같은 비율로 혼합합니다.

혼합물 10마이크로리터를 혈구계로 옮기거나 자동 세포 계수기에 입력하세요. 플레이트 맵에 샘플 ID, 상태, 바이오마커 등 모든 메타데이터를 입력하고 검증한 후 CSV 파일을 내보내세요. 이제 20에서 30마이크로리터 부피의 웰당 10,000개의 핵을 384 웰 플레이트에 분사합니다.

플레이트를 1000g에서 원심분리하고, 가속은 9, 감속은 4로 설정한 채, 10분간 4도 섭씨에서 원심분리합니다. 다음으로, 8% 파라포름알데히드와 PBS를 같은 부피로 첨가하여 핵을 고정하고, 실온에서 10분간 배큐합니다. 고정제를 제거한 후, PBS에 0.1몰 글리신 30마이크로리터를 추가하고 실온에서 5분간 배큐합니다.

글리신 용액을 제거하고 100마이크로리터 PBS로 웰을 두 번 세척하세요. 각 웰에서 PBS를 제거하고, 2%BSA와 0.5%Triton X-100이 포함된 블로킹 용액 30마이크로리터를 PBS에 첨가합니다. 배지판을 실온에서 1시간 정도 부양하세요.

차단액을 제거한 후, 4도 섭씨에서 1차 항체 용액 25마이크로리터에 배양합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 PBS로 웰을 세 번 세척하며, 각 세척은 상온에서 3분간 지속됩니다. 2차 항체 용액 25마이크로리터를 추가하고 4도에서 2시간 배양합니다.

그 다음, 100마이크로리터 PBS로 웰을 세 번 세척하며, 각 세척은 실온에서 3분간 지속됩니다. 핵을 염색하기 위해 염료 30마이크로리터를 0.01밀리리터당 밀리리터로 첨가하고, 100마이크로리터의 PBS로 한 번 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. GitHub 저장소에서 워크플로우 스크립트를 다운로드하세요.

다운로드가 완료되면 파일을 압축 해제해 내용을 추출하세요. 복제된 이미지 저장소를 올바른 스크립트 실행을 위해 워크플로우가 가정하는 형식과 폴더 구조가 일치하도록 정리하세요. 그 후 Linux나 Mac OS에서 동작하는 경우 터미널 애플리케이션을 열고, Windows를 사용하는 경우 WSL 애플리케이션을 실행하세요.

터미널에서 필요한 명령어를 입력하고 Enter를 눌러 작업 디렉터리를 복제된 저장소 폴더로 변경하세요. Python 3.10 버전의 Conda를 사용해 Image_workflow이라는 새로운 계산 환경을 만들고 Enter를 누르세요. 새로 생성된 Conda 환경을 'conda activate Image_workflow' 명령어로 활성화하세요.

활성화된 환경 내에 PIP 설치 프로그램을 사용해 파이썬 패키지 관리자인 Poetry를 설치하세요. 그 다음, Poetry를 사용해 워크플로우에 필요한 모든 필수 Python 패키지를 설치하세요. 이제 Conda 환경 내에서 CUDA를 구성하여 세분화 단계에서 그래픽 처리 장치 기능을 활성화하세요.

터미널 애플리케이션을 열고 폴더를 복제한 폴더로 변경하세요. 아래 명령어를 입력하고 Enter를 눌러 Conda 환경을 활성화하세요. 분석 매개변수를 설정하기 위해 VS Code나 Notepad 같은 코드 편집기나 텍스트 편집기에서 워크플로우 메인 파일을 엽니다.

프로젝트 이름을 설정하려면 출력 정리에 사용되는 짧은 파일 시스템 안전 식별자에 변수 p를 할당합니다. chs에서 특징 추출용 채널 목록을 설정하며, 해당 채널의 특징이 필요하다면 분할 채널도 포함합니다. ImageIndex와 채널 라벨을 키로 사용하여 파일 이름에서 이미지 채널 식별자를 이전에 저장한 정확한 대문자 구분 플레이트 맵 열 헤더로 매핑합니다.

그 다음, 데이터셋 경로에 orgDataLoadPath를, 필요하다면 이미지 하위 폴더에 orgDataSubfolder를, 출력 경로에 resultSavePath를 할당하여 데이터 위치를 설정하세요. imageFileFormat에서 파일 이름 확장자를 확인하세요. 그 다음, imageFileRegEx를 편집하여 행, 열, 필드, Z 위치, 채널 등 필요한 부분에 대해 파이썬 이름 캡처 그룹을 사용하게 합니다.

이제 segmentation_ch의 분할 채널을 물체 탐지에 사용되는 핵 채널로 설정합니다. illumiCorrection을 설정하고 true로 설정하여 기본 모델을 계산하고 적용할 수 있도록 조명 보정 사용 여부를 결정합니다. 그 다음 현미경 메타데이터를 사용해 voxel_dim 마이크로미터 단위의 물리적 복셀 크기를 ZYX로 설정합니다.

파일을 저장하고 각 매개변수를 검증한 후 편집기를 닫으세요. 마지막으로, 워크플로우 스크립트를 실행하여 이미지 판독값을 얻고 검증을 수행하며, 스크립트가 실행 중일 때 터미널을 열어두세요. 결과를 시각화하고 원본 이미지 판독값을 내보내 외부 소프트웨어에서 추가 분석할 수 있습니다.

유도 다능성 줄기세포의 대표 이미지에서는 DAPI, 라이신 27의 삼메틸화 히스톤 H3, 라이신 27의 아세틸화 히스톤 H3로 염색된 명확히 분리된 핵이 나타났습니다. 간 및 골격근 영상 분석에서 젊은 개체와 노인 샘플 간에 유의미한 차이가 나타났으며, 노령 OSKM 쥐는 노인에 비해 영상이 저하되어 부분 재프로그래밍을 시사했습니다. 개별 동물 분석 결과, 일부 오래된 OSKM 샘플은 오래된 쥐에 비해 이미지 값이 현저히 저하된 것으로 나타났습니다.

이 프로토콜은 연구자들이 다양한 세포 유형과 조직에서 단일 세포 해상도에서 연령 관련 염색질과 후생유전학적 조직 변화를 조사할 수 있게 합니다. 우리의 영상 기반 방법은 비파괴적이며, 염색질 구조를 보존하고 반복 측정이 가능하며, 대규모 또는 종단 연구에서 비용 효율성도 더 높습니다. 향후 연구는 더 많은 후생유전적 표지자를 추가하고 노화 관련 핵 내 구조 연구에 집중할 것입니다.