Name: 마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 RNA 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 학습하세요 마우스 안구 수정체 상피 세포와 섬유 세포를 분리하여 RNA를 추출하는 방법을. TRIZol과 원심분리 기법을 활용한 이 프로토콜은 수정체 유지 및 병리 연구에 필수적인 전사체 분석을 가능하게 합니다.

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<ol><li>Lovicu, F. J., Robinson, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLovicu%2C+FJ+%22Development+of+the+Ocular+Lens%22">Development of the Ocular Lens</a>. , Cambridge University Press. (2004).</li>
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<li>Beyer, E. C., Kistler, J., Paul, D. L., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+directed+against+connexin43+peptides+react+with+a+43-kd+protein+localized+to+gap+junctions+in+myocardium+and+other+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antisera directed against connexin43 peptides react with a 43-kd protein localized to gap junctions in myocardium and other tissues.</a> J Cell Biol. 108 (2), 595-605 (1989).</li>
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<li>Parreno, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+unlock+the+molecular+expression+and+cellular+structure+of+ocular+lens+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).</li>
<li>Paul, D. L., Ebihara, L., Takemoto, L. J., Swenson, K. I., Goodenough, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin46%2C+a+novel+lens+gap+junction+protein%2C+induces+voltage-gated+currents+in+nonjunctional+plasma+membrane+of+xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connexin46, a novel lens gap junction protein, induces voltage-gated currents in nonjunctional plasma membrane of xenopus oocytes.</a> J Cell Biol. 115 (4), 1077-1089 (1991).</li>
<li>Rong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+gja8+%28alpha8+connexin%29+in+mice+leads+to+microphthalmia+associated+with+retardation+of+lens+growth+and+lens+fiber+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disruption of gja8 (alpha8 connexin) in mice leads to microphthalmia associated with retardation of lens growth and lens fiber maturation.</a> Development. 129 (1), 167-174 (2002).</li>
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<li>Xia, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cell+clusters+and+upregulated+Aqp1+in+connexin+50+knockout+lens+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Altered cell clusters and upregulated Aqp1 in connexin 50 knockout lens epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (11), 27(2024).</li>
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안구 수정체는 선명한 이미지를 생성하기 위해 망막에 빛을 미세하게 집중시키는 투명한 기관입니다. 수정체는 전반구를 덮고 있는 단층 상피 세포와 조직의 벌크 질량을 구성하는 섬유 세포의 두 가지 주요 세포 유형으로 구성됩니다(그림 1). 수정체는 수정체 캡슐로 알려진 콜라겐 기저막으로 둘러싸여 있으며, 상피 세포가 단단히 부착되어 있습니다. 수정체가 성장함에 따라 적도의 상피 세포는 증식하고 동심원으로 수정체 위에 층층이 쌓인 섬유 세포의 초기 껍질로 분화합니다 1,2,3. 평생 수정체 성장은 발아대를 구성하는 적도 상피 세포의 작은 집단의 지속적인 증식에 달려 있습니다4. 섬유 세포가 성숙함에 따라 모든 세포 소기관은 분해되어 광산란 물체 5,6,7,8,9,10,11 을 제거하고 조직 투명성을 유지하며, 가장 안쪽의 섬유 세포는 결국 압축되어 단단한 수정 체 중심 9,12을 만듭니다. 주변의 수정체 캡슐로 인해 수정체의 세포 회전율이 없으며, 정섬유는 조직 주변이나 피질에 새로운 섬유가 추가됨에 따라 평생 동안 수정체의 중심에 남아 있습니다. 렌즈의 섬유 세포는 나이에 따라 다른 광학적 특성을 가지며, 주어진 각 단계(13)에서 다양한 생물학적 특성의 시간적 스냅샷을 제공할 수 있다.
이용 가능한 수술 옵션에도 불구하고 일반적으로 투명한 수정체의 혼탁으로 정의되는 백내장은 여전히 전 세계 실명의 주요 원인으로 남아 있습니다14. 백내장은 다른 병태생리학을 가진 수정체 상피, 피질 또는 핵에서 나타날 수 있습니다15. 그러나 백내장 형성의 세포 및 분자 메커니즘은 불분명합니다16,17. 이러한 다양한 유형의 백내장을 예방하고 수술에 대한 대안을 개발하는 방법을 더 잘 이해하려면 이러한 다양한 세포 유형이 수정체에서 항상성을 유지하는 방법을 더 잘 이해해야 합니다.
상피 세포와 섬유 세포는 수정체에서 서로 다른 생리학적 역할을 합니다. 예를 들어, 세포 증식은 수정체 상피에 제한된다18. 한편, 렌즈 섬유는 렌즈의 벌크 질량을 구성하여 렌즈(9)에 구조 및 굴절 특성을 제공한다. 수정체의 다양한 구획과 관련된 생물학적 과정에 대한 보다 미묘한 관점을 얻으려면 상피 세포와 섬유 세포를 별도로 조사해야 합니다. 여기에서는 섬유 세포 벌크 덩어리에서 상피를 분리하고, 각 분획에서 mRNA를 추출하고, 역전사 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 사용하여 이러한 전사체를 분석하는 방법을 제시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69079/69079fig1.jpg"> 
그림 1: 렌즈 해부학도. 수정체는 전반구를 덮고 있는 단층 상피 세포(파란색 및 주황색)와 수정체 섬유의 대량 덩어리(흰색)의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 조직은 수정체 캡슐(황갈색)으로 알려진 얇은 콜라겐 막으로 둘러싸여 있습니다. 전방 상피 세포(파란색)는 정지 상태인 반면 적도 상피 세포(주황색)는 증식, 분화 및 신장하여 수정체 주변에서 새로운 섬유 세포 층(흰색)이 됩니다. 새로운 세대의 섬유 셀은 동심원 쉘의 이전 세대 섬유 위에 겹쳐집니다. 가장 오래된 수정체 섬유 세포는 조직의 중앙으로 압축됩니다. 이 수치는 Cheng(2024)38에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69079/69079fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>원심분리기 및 로터</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>오후 14285554</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름, HPLC 등급</td><td>알파 이사르</td><td>22920</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(190프루프)</td><td>데콘 연구소</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(200프루프)</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>피셔 브랜드 펠렛 유봉</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>집게, 곡선; 학생용 핀셋 #7</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>집게, 직선; 듀몽 #5</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>집게, 직선; 학생용 핀셋 #4</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>킴와이프, 소형</td><td>킴벌리-클라크</td><td>34155</td><td>섬세한 작업 삭제</td></tr><tr><td>MicroAmp 접착 필름 어플리케이터</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate 광학 96웰 고속 투명 반응 플레이트(바코드 포함)</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>4483485</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫터</td><td>에펜도르프</td><td>&nbsp; 01-671-120</td><td></td></tr><tr><td>현미경, 해부</td><td>칼 자이스</td><td>스테레오 디스커버리.V8</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp 광학 접착 커버</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp 열 순환기</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>MixMate 플레이트 와류 믹서</td><td>에펜도르프</td><td>5353000529</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP28191</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume UV-Vis 분광 광도계</td><td>써모 사이언티픽</td><td>ND-원-W</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 미니트레이</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>12-565-154</td><td>해부 트레이</td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>VWR</td><td>201007-012</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm x 15mm</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, 1x Dulbecco's</td><td>깁코</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 10 및 마이크로; L 눈금이 매겨진</td><td>미국 사이언티픽</td><td>1161-3700</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 1250 & micro; L XL 눈금</td><td>미국 사이언티픽</td><td>1161-1720</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 및 마이크로; L 프로파일 눈금이 매겨짐</td><td>미국 사이언티픽</td><td>1163-1700</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>역전사 효소, 위 첨자 IV VILO&nbsp;</td><td>인비트로젠</td><td>11756050</td><td>가공성이 높고 열안정성이 높은 역전사 효소</td></tr><tr><td>RNA 세척 및 농축기 5 키트</td><td>자이모</td><td>ZR1013 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>RNase-프리 워터</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP2819</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>시그마</td><td>R2020</td><td>RNase 오염 제거 용액</td></tr><tr><td>SealRite 미세 원심분리기 1.5 mL 튜브</td><td>미국 사이언티픽</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼파인 반나 8cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501778</td><td>가위</td></tr><tr><td>qPCR용 TaqMan FAST Advanced Master Mix</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>4444557</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 분석(FAM) 프로브 (MTO)</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>4448892</td><td></td></tr><tr><td>트리졸</td><td>인비트로젠</td><td>15596026</td><td>산-구아니디늄-페놀 용액</td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>써모 사이언티픽</td><td>88880017</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 rna 분리

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

수정체 상피와 섬유는 6주에서 7주 된 야생형 마우스에서 분리되었습니다. 이 실험에는 3마리의 마우스를 사용하였고, 각 마우스의 2개의 수정체 캡슐 또는 2개의 섬유 세포 덩어리를 하나의 생물학적 복제를 위해 함께 모았습니다. 프로토콜에 설명된 바와 같이, RNA는 TRIzol 시약상 분리를 사용하여 추출되었습니다. 평균적으로 한 쌍의 수정체 상피와 섬유 벌크 덩어리는 각각 0.8μg(SD ± 0.2) 및 9.7μg(SD ± 2.3)의 RNA를 생성했습니다. 15 μL 용출의 평균 농도는 상피 및 섬유 샘플에 대해 각각 55.4 ng/μL(SD ± 16.3) 및 650.0 ng/μL(SD ± 152.2)였습니다. 5ng/웰 반응을 사용하면 이론적으로 이 프로토콜을 사용하여 분리된 단일 쌍의 수정체 상피에서 평균 160개의 반응이 가능합니다. A260/280 비율로 측정한 평균 RNA 순도는 상피의 경우 1.92(SD ± 0.05), 섬유의 경우 2.05(SD ± 0.01)로 단백질 오염이 최소화되었음을 나타냅니다. 일반적으로 ~...

마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 RNA 분리

The lens is a specialized, transparent tissue in the anterior chamber of the eye that is comprised of two major cell types, epithelial cells and fiber ...

rna-isolation-from-mouse-ocular-lens-epithelium-fiber-cell-bulk

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리 다운스트림 RNA 분석에 대 한 배수 채널 (TM)를 격리 하기 위한 재현성 레이저 캡처 기정 (LCM)에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. TM에 유전자 발현에 변화를 분석 하는 능력은 TM 관련 눈 질병의 근본적인 분자 메커니즘을 이해에 도움이 됩니다.

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

눈물 샘 (LG)에는 α-평활 근 액 틴를 발현 하는 두 가지 세포 유형 (α Sma)이 있습니다. MECs는 많은 선 조직에서 발견 되는 외 배 엽 기원 이며, 심 낭은 내 배 엽 기원의 혈관 평활 근 세포입니다. 이 프로토콜 뮤 린 LGs에서 MECs 및 심 낭을 분리 합니다.

성인 뮤 린 눈물과 턱 밑 동맥에서 Myoepithelial 세포의 고립

이 프로토콜은 복잡한 세포 간 간지화 및 막 구조를 연구하기 위해 면역형광 염색을 위해 말초, 성숙 및 핵 수정체 섬유 세포를 준비하는 방법을 설명합니다.

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens(눈 수정체의 피질과 핵에서 다발 및 단일 섬유 세포의 준비 및 면역형광 염색)

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

Mouse Primary Lens 상피 세포 배양 최적화: 트립신화에 대한 종합 가이드

본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.

Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

여기서는 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적 소화를 통해 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포기체 y와 같은 후속 응용과 호환됩니다.

마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 채취하는 프로토콜

학습하세요 마우스 안구 수정체 상피 세포와 섬유 세포를 분리하여 RNA를 추출하는 방법을. TRIZol과 원심분리 기법을 활용한 이 프로토콜은 수정체 유지 및 병리 연구에 필수적인 전사체 분석을 가능하게 합니다.

마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 RNA 분리

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