Name: 공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 37 s
Description: 배우세요 공기-액체 계면 배양법을 이용하여 인간 유도 만능 줄기세포에서 모발 피부 오가노이드를 생성하는 방법을. 이 기술은 피부 질환 연구와 생리학적 피부 구조 재현에 활용됩니다.

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<ol><li>Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Nurses+Assoc%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the skin.</a> J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM/F12</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#12634010</td><td>텍스트에서는 고급 매체라고 불립니다.</td></tr><tr><td>ALK5, 인히브. TGFb 타입 1, SB431542</td><td>토크리스 생명과학</td><td>#1614</td><td>알리코트, -20 & deg에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 7일간 C를 복용하며, nbsp;</td></tr><tr><td>항-CD104 쥐 단클론 클론 439-9B 항체</td><td>BD 생명과학</td><td>#555719</td><td>NA</td></tr><tr><td>항콜라겐 IV 다클론 항체</td><td>메르크밀리포어</td><td>#Ab769</td><td>NA</td></tr><tr><td>항사이토케라틴 10 토끼 다클론 항체</td><td>바이오레전드</td><td>#905401</td><td>NA</td></tr><tr><td>항로리크린 토끼 다클론 항체</td><td>바이오레전드</td><td>#905101</td><td>NA</td></tr><tr><td>항-PMEL 마우스 단클론 항체</td><td>노부스 바이오로지컬스</td><td>#NBP2-29407&nbsp;</td><td>NA</td></tr><tr><td>비타민 A 제외 B-27 보충제</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#12587010</td><td>알리코트, -20 & deg에 저장; 참고;</td></tr><tr><td>세포 배양 삽입물</td><td>그레이너 바이오-원</td><td>#665641</td><td>12웰, 공극 크기 0.4 & 마이크로; m; 투명 (박스당 48개의 삽입물); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html</td></tr><tr><td>콜라겐 타입 I</td><td>코 닝</td><td>#354249</td><td>기본 용액은 4도 정도로 유지하세요; C</td></tr><tr><td>일회용 멸균 메스 0507 No. 21</td><td>스완 모튼</td><td>#0507</td><td>NA</td></tr><tr><td>둘벡코 s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#14190094</td><td>NA</td></tr><tr><td>에센셜 6 (E6) 미디엄</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#A1516401</td><td>hiPSC 최소 매체(hiMinM)라고 불리며, 본문에서.</td></tr><tr><td>파수딜</td><td>LC 연구소</td><td>#F-4660</td><td>1000배 재고 용액을 분할 단위로 만들어 -20 & 도C 온도에서 저장하세요. 해동 후에는 4도에서 유지하세요; 최대 14일간 C를 복용하며;</td></tr><tr><td>부드러운 세포 해리&nbsp; 시약</td><td>줄기세포 기술</td><td>#100-0485</td><td>NA</td></tr><tr><td>글루타맥스 보충제</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#35050038</td><td>NA</td></tr><tr><td>인간 FGF-2 기본 프레늄 등급</td><td>밀텐이 바이오텍</td><td>#130-093-842</td><td>알리코트, -80 & 도수에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 7일간 C를 복용하며, nbsp;</td></tr><tr><td>LDN 193189 이하이드로클로라이드</td><td>토크리스</td><td>#6053</td><td>알리코트, 빛에 민감하며, -20 & 도에서 저장; 참고;</td></tr><tr><td>마트리젤 성장인자 저저막 기질 축소</td><td>코 닝</td><td>#354230</td><td>알리코트, -20 & deg에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 7일간 C를 복용하며, nbsp;</td></tr><tr><td>2-머캅토에탄올</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#21985023</td><td>유해 물질, 독성, 부식성, 자극성, 건강 및 환경 위험.</td></tr><tr><td>나오</td><td>머 크</td><td>#567530-250MG</td><td>유해하고 부식성 있으며 자극적인 물질입니다. 즉석에서 해결책을 준비하세요.</td></tr><tr><td>신경기저 매질</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#21103049</td><td>신경 기저 매체라고 불립니다. 본문에서.</td></tr><tr><td>노르모신 50 mg/ml</td><td>인비보젠</td><td>#ant-nr-1</td><td>검사에서는 항생제-항균 보충제라고 부릅니다. 알리코트, -20 & deg에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 14일간 C를 복용하며;</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96-WellU-bottom 마이크로플레이트</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#174929</td><td>NA</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 174930 24웰 다접시</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#174930</td><td>NA</td></tr><tr><td>N2 보완</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#17502048</td><td>알리코트, -20 & deg에 저장; 참고;</td></tr><tr><td>궤도 셰이커</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#88881102</td><td>NA</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#15070063</td><td>NA</td></tr><tr><td>재조합 인간 BMP4 단백질</td><td>R& D 시스템즈</td><td>#314-BP-010</td><td>알리코트, -80 & 도수에 저장; C 앤 nbsp; 4도 & 도(4도) 유지 최대 7일간 C를 복용하며, nbsp;</td></tr><tr><td>스템플렉스(SF) 미디엄</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>#A3349401</td><td>hiPSC 유지 배지(hiMM)라고 하며, 본문에서.</td></tr><tr><td>SteriMax smart&nbsp;- 적외선 루프 살균기</td><td>WLD-TEC</td><td>#4.002.000&nbsp;</td><td>선택적</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>머 크</td><td>#T4537-1EA</td><td>스타일 5; 미세한 바늘처럼 날카롭고 자성 방지 스테인리스 스틸</td></tr><tr><td>비트론넥틴</td><td>줄기세포 기술</td><td>#07180</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Planar Hair-bearing Skin Organoids Using an Air-Liquid Interface Culture System

낭포성 SO 생성을 위한 최적화 및 체크포인트는 광범위하게 설명되었습니다14. 따라서 여기에 제시된 방법은 낭포성 오가노이드의 개발 중에 평가해야 할 주요 체크포인트(그림 2A), 평면 SO로의 전환에 적합한 것의 선택(그림 2B) 및 결과 평면 SO의 품질을 평가하는 데 사용되는 기준(그림 1B-D 및 그림 4).
낭포성 SO 개발의 첫 번째 핵심 단계는 0일에 웰에 존재하는 대부분의 세포를 통합하는 단일의 조밀한 세포 응집체의 형성입니다(그림 2A). 이는 효율적인 원심분리와 결합된 hiPSC의 신중하고 신속한 취급을 통해 달성되며, 그 결과 웰 중앙에 세포가 균질하게 분포됩니다(그림 2A, -2일). 표면 외배엽의 적절한 유도는 3일째까지 응집체의 가장 바깥층에 얇고 투명한 상피를 형성하고(그림 2A), 이는 중간엽 세포 유도 후 8일째까지 중간엽 세포의 어두운 코어를 포함하는 투명한 낭포성 응집체로 발달합니다. 12일에서 20일 사이에 상피 낭종은 낭종의 한 극에 축적되는 얇은 중간엽 세포층으로 덮이게 됩니다(그림 2A, 12일). 상피 세포와 중간엽 세포의 성공적인 공동 유도는 궁극적으로 층화된 상피를 초래하여 50일에서 80일 사이에 보이게 되는 모발 판과 못의 형성을 가능하게 합니다(그림 2A,B). 이러한 발달 체크포인트를 기반으로 적절한 SO를 선택함으로써 평면 SO로의 전환 시 형태학적 및 크기 변동성을 최소화할 수 있습니다.
모발 판자 또는 못의 존재는 평면 SO로의 추가 개발을 위해 낭포성 SO를 선택하기 위한 주요 포함 기준입니다. 눈에 보이는 판상의 부재는 일반적으로 표피 층화의 결함으로 인해 발생하며, 이는 매우 얇게 보입니다(그림 2B, 50일, 중간 패널). 편평화를 위해 부산물이 한 극에 집중되어 있고 전체적으로 부산물이 최소화된 큰 낭종(직경 5mm 이상)만 사용되며 분극되지 않은 부산물이 있는 낭종은 제외됩니다(그림 2B).
평면 구성에 들어가면 SO의 1차 품질 검사는 입체 현미경에서 HF 성장의 거시적 모니터링에 의존합니다. HF는 ALI 배양의 27일 동안 점진적으로 늘어나며, 피지선은 14일경에 보이게 되고 색소 침착은 시간이 지남에 따라 점차 증가합니다(그림 1B,C). 얇은 콜라겐 겔 바로 아래에 있는 인서트 멤브레인에 의해 부과되는 공간적 제약으로 인해 평면 SO의 주변에 위치한 HF만 완전히 성장할 수 있으며 인서트와 평행한 방향으로 성장합니다(그림 1C). 특히, 모간은 피부 표면 너머로 거의 돌출되지 않습니다. 개발된 평면 SO의 품질을 추가로 평가하기 위해 파라핀 또는 OCT에 포매하고 절편화하고 염색하여 구성과 형태를 검사할 수 있습니다. H&amp;E 염색은 이들의 구조가 완전히 층화된 상피와 기저막으로 분리된 진피를 가진 인간 피부의 구조와 매우 유사하다는 것을 보여줍니다(그림 4A). 다양한 표피층, 피지선 및 멜라닌 세포에 대한 특정 마커를 사용한 면역형광 염색은 평면 SO의 인간 피부와 유사한 조직 구조를 추가로 확인합니다(그림 1D 및 그림 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig1.jpg"> 
그림 1: ALI 배양 시스템을 사용하여 hiPSC에서 HF를 포함하는 평면 SO를 생성하는 워크플로. 주요 단계의 개략적 표현과 대표 이미지가 표시됩니다. (A) 본질적으로 이전에 설명한10과 같이 80일경에 눈에 보이는 모발 판자/못이 형성될 때까지 낭포성 SO의 생성. (B) 낭포성 SO는 I형 콜라겐 코팅 세포 배양 삽입물에서 표피면이 위를 향하도록 절개 및 평평합니다. ALI 배양은 가습 조건에서 21일 동안 유지된 후 건조한 조건에서 6일 동안 유지됩니다. (C) (B)에 표시된 영역의 고배율 보기로, 모낭 성장, 피지선 유사 구조 발달(화살촉) 및 시간 경과에 따른 점진적인 색소 침착을 보여줍니다. (D) 피지선 유사 구조를 표시하는 나일 레드 또는 멜라닌 세포를 염색하는 항-PMEL 항체와 함께 항형 IV 콜라겐 항체로 표지된 평탄화 후 27일째에 평면 SO 절편의 공초점 이미지. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바: 200μm (A); 500 μm (B, C); 50 μm (D)입니다. 약어: SO = 피부 오가노이드; HF = 모낭; hiPSC = 인간 유도만능줄기세포; ALI = 공기-액체 인터페이스; Col IV = IV형 콜라겐; PMEL = 프레멜라나좀 단백질; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig2.jpg"> 
그림 2: SO 생산 중 주요 단계에서 세포 응집체 형태의 대표적인 이미지. (A) 서로 다른 단계에서 적절한(왼쪽 패널) 및 부적절한(중간 및 오른쪽 패널) 형태를 갖는 낭포성 SO의 대표 이미지. -2일째에 세포 응집체는 균일한 분포를 나타내야 하는 반면 (왼쪽 패널), 원심분리 후 부적절한 플레이트 취급은 세포 분포를 방해할 수 있습니다 (오른쪽 패널). 0일째에 잘 형성된 응집체는 조밀하고 조밀한 세포 클러스터로 나타나며 (왼쪽 패널), 낮은 세포 생존력은 광범위한 세포 사멸과 조밀한 3D 구조의 손실을 초래합니다 (오른쪽 패널). 3일째에 뚜렷한 외부 상피층이 보이게 되 고(왼쪽 패널), 부재는 BMP4 농도에 최적화가 필요함을 나타낼 수 있습니다 (오른쪽 패널). 12일째에 중간엽 세포는 한 극에 축적되어 상피 낭종 (왼쪽 패널)을 감싸기 위해 이동하는 반면, 과도한 상피(중간 패널) 또는 중간엽(오른쪽 패널) 분화는 적절한 상피 계층화를 방해합니다. 50일째에 SO는 한쪽에는 낭성 피부가 있고 다른 쪽에는 주로 연골과 같은 부산물이 있는 양극성 형태를 나타냅니다 (왼쪽 패널). 과도한 상피(중간 패널) 또는 중간엽(오른쪽 패널) 분화는 적절한 피부 발달을 방해합니다. (B) 약 80일에 눈에 보이는 헤어 페그가 있는 낭포성 SO의 대표 이미지. 피부에 대한 부산물의 다양한 비율(점선 왼쪽)에 주목하십시오. 가장 왼쪽에 있는 3개의 패널은 2-4개의 평면 SO를 생성할 수 있는 반면, 가장 오른쪽 패널은 평탄화에 품질이 충분하지 않은 SO를 보여줍니다. 스케일 바: -2일, 50일 및 80일째 500μm; 0일, 3일 및 12일째 200μm. 약어: SO = 피부 오가노이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig3.jpg"> 
그림 3: 평면 SO를 생산하기 위한 기술 단계의 개략도. LAF 후드 내의 실체 현미경으로 낭포성 SO의 평탄화를 수행합니다. (A) 멸균 메스를 사용하여 낭포성 SO에서 축적된 부산물을 극을 절제합니다. (B) 조직 전개를 용이하게 하기 위해 SO의 상지와 하지를 다듬습니다. (C) 평면 조직을 2-4 조각으로 자릅니다. 멸균 겸자를 사용하여 각 조각을 표피면이 위로 향하게 하여 콜라겐 코팅 인서트에 옮기고 평평하게 만듭니다. (D) 평평한 조직이 포함된 배양 삽입물을 600μL의 배지가 들어 있는 표준 12웰 플레이트에 넣습니다. (E) 플레이트를 37°C에서 5%CO2와 함께 배양합니다. (F) (B)에 묘사된 피부 오가노이드의 개략적인 횡단도. (G) (C)에 묘사된 피부 오가노이드의 개략적인 횡단도. (H) 600μL의 배지를 포함하는 12웰 플레이트에 위치한 세포 배양 인서트에 부어진 I형 콜라겐 겔에 배치된 평면 SO의 이미지. 약어: SO = 피부 오가노이드; LAF = 층류 공기 흐름. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69088/69088fig4.jpg"> 
그림 4: hiPSC 유래 평면 SO의 특성화. (A) 평탄화 후 1일 및 27일째에 H&amp;E-염색된 평면 SO의 대표적인 명시야 이미지. 27일째까지 평면 SO는 다층화된 표피와 피지선 유사 구조(화살촉)를 포함하는 HF로 피부 성숙을 보여줍니다. (B) 항-β4 인테그린 및 항-케라틴 10 또는 항-로리크린 항체로 염색된 평면 SO 절편의 공초점 이미지는 1일째에 초기 기저부 분화(KRT10+ 세포) 및 27일째에 후기 분화(LOR+ 층)를 보여줍니다. 핵은 DAPI로 대조염색됩니다. 스케일 바: 50μm (A); 100 μm (B). 약어: SO = 피부 오가노이드; hiPSC = 인간 유도만능줄기세포; H&amp;E = 헤마트실린 및 에오신; β4 = b4 인테그린; KRT10 = 케라틴 10; LOR = 로리크린; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69088/69088fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived skin organoids (SOs) containing hair follicles provide a sophisticated in vitro model for ...

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 흑색종 진행을 연구하기 위해 체외 3D 유기형 피부 재건을 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 피부 모델은 생체 내 장기의 구조와 다세포 복잡성을 모두 모방합니다.

유기형 전체 피부 재구성 생성: 인간 피부 샘플을 사용하여 3D 피부 모델을 구축하는 절차

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

이 원고는 뽑은 모발에서 인간 각질세포를 유도 및 유지하고 우발적 벡터에 의한 통합이 없는 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)를 후속 생성하기 위한 단계별 절차를 제공합니다.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

본 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포 유래 제2형 폐포 상피유사세포(iAT2s)를 기술한다. 이들 세포는 3D 배양물에서 자가재생 구체로서 배양되거나 공기-액체 계면(ALI) 배양에 적응될 수 있다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 유형 2 폐포 상피 세포의 3D 구체 및 2D 공기-액체 계면 배양 생성

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

이 프로토콜은 인간 만능 및 유도 만능 줄기 세포로부터 자가 조직화 혈관의 생성을 설명합니다. 이러한 혈관 네트워크는 혈관주위세포, 평활근 액틴 및 연속적인 기저막으로 둘러싸인 광범위하고 연결된 내피 네트워크를 나타냅니다.

만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

배우세요 공기-액체 계면 배양법을 이용하여 인간 유도 만능 줄기세포에서 모발 피부 오가노이드를 생성하는 방법을. 이 기술은 피부 질환 연구와 생리학적 피부 구조 재현에 활용됩니다.

공기-액체 계면 배양 시스템을 이용한 인간 유도 만능 줄기세포 유래 평면 모발 피부 오가노이드의 생성

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