쥐 무릎 아래 절단 모델 및 즉각적인 표적 근육 재신경

본 연구는 신경 손상 및 절단과 관련된 통증과 신경 재배치가 해당 통증에 미치는 영향을 조사합니다. 절단은 표준 통증 평가를 제한합니다. 본 프로토콜은 절단 후 통증 행동을 측정하기 위해 수정된 검사 및 대체 검사를 사용합니다.

먼저, 8~10주령이며 체중이 250~300g인 Sprague Dawley 쥐를 준비합니다. 워밍 패드(warming pad)의 전원을 켜고 멸균된 수술 부위를 준비합니다. 수술에 필요한 모든 멸균 도구와 재료를 배치합니다.

isoflurane을 이용해 4% 유도 및 1~2% 유지 용량으로 쥐를 마취시킨 후, 하부 등 쪽에서 시작하여 뒷다리 전체 길이를 따라 털을 깎습니다. 수술 부위를 Povidone iodine 소독액으로 세척한 다음 알코올 솜으로 닦아냅니다. 이 과정을 두 번 더 반복합니다.

투베르쿨린 주사기를 사용하여 meloxicam 1 mg/kg을 피하 주사합니다. 자를 사용하여 무릎 관절선을 표시합니다. 그리고 무릎에서 원위 방향으로 2 cm와 3 cm 지점에 두 개의 표시를 추가로 합니다.

메스를 사용하여 무릎에서 원위쪽으로 3cm 지점에 피부를 원형으로 절개합니다. 피부가 자유롭게 젖혀질 때까지 둔성 및 예성 박리를 통해 피부를 하부 근육으로부터 원형으로 분리합니다. 조직 층을 보존하면서 뼈가 나타날 때까지 심부 근육층을 통해 박리 과정을 반복합니다.

마커를 사용하여 원주 절개 부위에서 근위쪽으로 1cm 지점의 경골과 비골에 표시합니다. 소형 골절단 가위를 사용하여 표시된 위치에서 경골과 비골을 절단합니다. 전기 소작기를 사용하여 출혈을 조절하고 지혈합니다.

뼈 끝부분을 살펴보고 필요에 따라 날카로운 가장자리를 뭉툭하게 만들거나 다듬습니다. 4-O 흡수성 편사 봉합사를 사용하여 경골 위 근육 구획의 전방 가장자리를 근접시킨 후, 4~6개의 간격을 균등하게 둔 단속 봉합으로 고정합니다. 전방 및 후방 근육 구획을 뼈 위에서 함께 정렬하여 닫음으로써 근육 패드를 형성합니다.

체중 부하 부위인 단면(stump)에 봉합사가 놓이지 않도록 주의하면서, 4-O 흡수성 꼬임사(braided sutures)를 이용해 피부를 외측으로 단순 결절 봉합합니다. 절개선을 따라 피부 접착제를 도포합니다. 대퇴골에서 후방으로 약 5 mm 떨어진 지점에 1.5~2 cm 길이의 둔부 갈라짐 방향(gluteal splitting) 종절개를 가합니다.

둔근과 햄스트링 근육을 둔성 박리로 분리하여, 좌골신경의 삼분지 근위부를 노출시킵니다. 미측 대퇴근(caudal femoralis 또는 CFM) 하단에 위치한 큰 분지와 그 분지들을 포함하여 근위 운동 분지들을 확인합니다. 핀셋으로 CFM을 들어 올린 후 이를 절단합니다.

미세수술용 Dumont 핀셋을 사용하여 둔성 박리로 반막양근 및 대퇴이두근 분지를 신경 박리하십시오. 신경외막을 잡고 미세 곡선 스프링 가위로 세로 방향으로 절개하십시오. 그 다음 신경 분지들을 분리하십시오.

미상대퇴근 분지를 보존하고 좌골신경 주간 근처에서 나머지 분지들을 절단합니다. 문합이 용이하도록 운동 분지들을 하방으로 구부립니다. 곡선형 스프링 가위로 신경외막을 열고 절단하여 좌골신경 삼분지부를 신경화합니다.

미세 핀셋을 사용하여 신경 가지들을 조심스럽게 분리합니다. 삼분기점(trifurcation)에서 원위쪽으로 5~10mm 지점에서 총비골신경, 경골신경, 비복신경의 세 가지 가지를 각각 핀셋으로 잡습니다. 텐션을 가한 상태에서 각 신경의 원위단을 절단하고 해당 분절의 5~10mm를 절제합니다.

10-0 나일론 봉합사를 사용하여 먼저 총회음신경을 반막양근에 연결함으로써 접합술을 수행합니다. 봉합당 최소 3개의 매듭을 사용하십시오. 신경이 과하게 조이거나 접히지 않도록 장력이 없는 상태로 배치하고, 접합 부위에 급격한 굴곡이 생기지 않도록 정렬합니다.

그 다음 경골신경을 대퇴이두근의 큰 분지에 연결하고, 비복신경을 대퇴이두근의 작은 분지에 연결합니다. 표적 근육 재신경지배가 없는 절단술의 경우, 좌골신경 분지들을 노출시킨 후 5-O 실크 봉합사와 포셉을 사용하여 총비골신경, 경골신경, 비복신경을 결찰하며, 이때 결찰사가 신경을 압착하고 4개의 평결절로 고정되었는지 확인합니다. 매듭을 이용해 각 신경을 근위부로 부드럽게 당긴 후 결찰 부위에서 원위부로 1~2mm 지점을 절단합니다.

원위 신경 분절의 10 millimeters를 제거한 후, 이전에 시연한 방식대로 절단을 진행합니다. 절개 부위를 봉합한 후, 절개선을 따라 피부 접착제를 도포합니다. 7일 동안 쥐의 상처 무결성, 감염 징후, 통증 또는 고통 여부를 매일 관찰하고, IACUC 가이드라인에 따라 필요한 경우 조치를 취합니다.

Von Frey 테스트로 측정한 기계적 철회 임계값은 기선 대비 유의하게 감소하였으며, 절단 후 여러 시점에서도 계속 낮게 유지되었습니다. 핀 테스트 결과, 기선과 비교하여 시간이 지남에 따라 유해 반응이 증가하는 경향이 나타났습니다. 그루터기의 냉각 과민성은 강하게 나타났으며, 모든 시점에서 기선 대비 지속적으로 유지되었습니다.

본 프로토콜을 통해 절단 상황에서 다양한 신경 관리 전략을 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 가장 어려운 점은 너비가 1mm 미만인 신경을 외상 없이 조작하는 것입니다. 향후 연구에서는 본 연구를 확장하여 모델을 개선하고 환상지 통증 연구를 위한 보다 신뢰할 수 있는 방법을 개발할 수 있을 것입니다.