시험관 내 상피 오가노이드-T 세포 공동 배양 시스템을 이용한 상류 기억 CD8 T 세포 분화
2026년 2월 3일
CD8 T 세포의 분화 및 기능을 시험 관 내에서 연구하기 위해, CD8 T 세포를 마우스에서 분리하여 기존에 형성된 감염된 쥐 질 상피 유기체와 장기간 공동 배양할 수 있습니다. 여기서는 이 과정을 설명하고 공동 배양 시 상주 기억 T 세포 표지자의 획득을 평가합니다.
우리 연구는 여성 생식기 내 CD8 상주 기억 T 세포를 조사하며, 감염과 질병이 이들의 거주성, 기능, 유지 및 치료 잠재력에 어떤 영향을 미치는지 조사합니다. 기존 방법들은 거주하는 기억 T 세포의 생존율과 표현형 안정성을 제한합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 T 세포 배양을 통해 조직 거주를 유도함으로써 확장 가능한 시험관 내 연구를 가능하게 합니다.
우선, 24웰 플레이트의 웰당 20마이크로리터의 기저막 추출물에 10,000개의 세포 밀도를 질내 상피 오가노이드(VEO)를 배팅합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣고 37도 섭씨에서 7일에서 10일간 배양 상태를 유지하세요. 공동 배양 하루 전, 지정된 웰에서 세포 배양 배지를 흡입하고 DPBS로 웰을 세척합니다.
DPBS를 흡입한 후, 미리 가열된 0.25% 트립신 EDTA 600마이크로리터를 우물에 투여합니다. BSA 코팅된 P1000 피펫을 사용하여 완전히 재현탁하여 기저막 추출물을 기계적으로 교란시키고, 우물의 내용물을 BSA 코팅된 멸균 15밀리리터 원뿔관으로 옮깁니다. 이제 원뿔형 관을 섭씨 37도 물에 넣으세요.
5분 후에는 RPMI에 10% FBS 10밀리리터를 추가하여 트립신화 과정을 억제합니다. 그 후 튜브를 원심분리기에 넣고 500G에서 4도 섭씨로 5분간 돌린 후 상원액을 버립니다. BSA 코팅된 피펫 팁을 사용해 펠릿을 100에서 300 마이크로리터의 T세포 오가노이드 배양 배양지 또는 일반 DMEMF 12에 재현탁합니다.
혈구계를 사용해 세포 수를 세어보세요. 총 세포 수와 알려진 바이러스 역가를 사용하여 감염 중복수를 0.1로 달성하는 데 필요한 바이러스 양을 계산합니다. 감염 대상으로 선택된 VEO 웰에서 세포 배양 배지를 흡입합니다.
각 웰을 500마이크로리터의 미리 데운 DPBS로 세척한 후, 플레이트를 37도 인큐베이터에 5분간 넣어 보관합니다. 5분 후에는 DPBS를 버리세요. 감염 중복률 0.1을 달성하기 위해 충분한 바이러스 입자를 포함한 500마이크로리터의 오가노이드 배지를 추가합니다.
접시를 37도 인큐베이터에 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 넣고, 20분에서 30분마다 손으로 부드럽게 돌리세요. 도금에 필요한 적절한 양의 기저막 추출물을 영하 80도에서 4도로 옮겨 8시간 동안 녹여. VEO를 현미경으로 확인해 크기와 전반적인 건강 상태를 평가하세요.
VEO가 직경 약 100마이크로미터이며 균일한 둥근 형태와 최소한의 단일 세포임을 확인하세요. VEO 웰에서 세포 배양 배지를 흡인하고, 각 웰마다 2도에서 8도 사이에서 유지된 500마이크로리터의 차가운 멸균 DPBS로 세척합니다. DPBS를 제거한 후, 각 웰에 200에서 500 마이크로리터의 냉 오가노이드 수확 용액을 추가하여 기저막 추출물 방울에 비해 최소 10배 이상의 부피를 유지합니다.
그 다음 BSA 코팅된 P200 피펫을 사용해 기저막 추출물을 기계적으로 교란합니다. 이제 판을 약 분당 100회전, 섭씨 4도에 맞춰 20분 동안 궤도 셰이커에 올려놓습니다. 배양 후에는 BSA 코팅된 피펫 팁을 사용해 각 웰의 내용을 혼합하여 BSA 코팅된 멸균 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
튜브를 원심분리기에 넣고 500G로 4도 섭씨에서 5분간 돌립니다. 그 후 상원액을 버리세요. VEO 펠릿을 5에서 10밀리리터의 차가운 DPBS로 세척한 후, 500G에서 4도에서 5분간 원심분리합니다.
DPBS를 흡입한 후 P1000 피펫 팁을 사용해 펠릿을 1밀리리터 T세포 오가노이드 배양 배양액에 재현탁한 뒤, T세포가 공동 배양할 준비가 될 때까지 VEO 현탁액을 얼음 위에 올려놓습니다. T세포를 채취할 때는 광학 현미경으로 휴식 중인 T세포를 확인하여 크기와 전반적인 건강 상태를 평가하세요. T 세포가 일부 군집, 형태 확대, 눈에 띄는 세포 잔해나 조각이 없음을 확인하세요.
P1000 피펫을 사용해 웰의 각 모서리에서 여러 번 위아래로 피펫팅하여 T 셀을 재현탁합니다. 원뿔형 튜브를 채취하여 살아있는 CD8 T세포의 총 수를 세세요. 다음으로 T세포 현탁액을 원심분리기에 넣고 584G로 4도 섭씨에서 5분간 회전시킵니다.
상원액을 버리고 T세포 펠릿을 10밀리리터의 T세포 오가노이드 배양 배양지에 재현탁합니다. 그 후 적절한 수의 T 세포를 미리 준비한 VEO가 포함된 원뿔형 튜브에 옮겨 세포들을 결합합니다. VEO와 T-셀 현탁을 결합한 것을 원심분리기에 넣고 584G에서 4도 섭씨에서 5분간 다시 회전시킵니다.
상정액을 버린 후, VEOs와 T 세포를 적절한 용량의 기저막 추출물에 재현탁합니다. 그 다음 또 다른 피펫 팁을 사용해 현탁액을 미리 예열된 조직 배양 판에 도금하며, 24웰 플레이트에 대해 웰당 20마이크로리터를 분사합니다. 이제 조직 배양 플레이트를 뒤집어 37도 인큐베이터에 거꾸로 넣으세요.
기저막 추출물의 완전한 접착과 고체화를 위해 30분을 두세요. 배양 기간 후에는 보충된 완전한 T세포 오가노이드 배양지를 각 웰에 조심스럽게 추가하세요. 24웰 플레이트는 웰당 500마이크로리터를, 96웰 플레이트는 250마이크로리터를 공급하며, 베이스먼트 멤브레인 추출물 방울을 방해하지 않도록 웰 측면에 매체를 배치합니다.
샘플이 유세포분석 분석을 위해 채취될 때까지 배양 배지를 이틀마다 교체하세요. 노란 형광 단백질을 발현하는 림프구성 융모수막염 바이러스에 감염된 7일 된 마우스 VEO는 동배양 후 4시간 이내에 풍부한 바이러스 복제를 보였으며, 이는 오가노이드 내 형광 신호로 확인할 수 있다. 감염된 오가노이드 근처에 CD8 T세포가 축적되는 현상은 공동 배양 중 후반 시점에 두드러지게 나타났습니다.
CD8 T세포의 점진적 응집은 감염된 오가노이드에서 이후 시점에 노란색 형광 단백질 신호의 눈에 띄는 감소와 관련이 있었습니다. 감염된 VEOs와 공동 배양된 CD8 T세포는 시간이 지남에 따라 CD 69와 CD 103의 발현이 증가하여 조직 내 기억 표현형의 획득을 시사합니다. 항원자극 CD69 양성, CD103 양성, CD8 T세포는 자극되지 않은 대조군에 비해 세포 내 인터페론 감마와 인터루킨 2 생성이 유의미하게 증가하였습니다.
이 프로토콜은 CD8 상주 기억 T 세포의 시험관 내 연구를 가능하게 하여 동물 모델에 의존하지 않고 상피세포와 T 세포를 효율적으로 조작할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 과제는 건강하고 생존 가능한 T세포와 질 상피 오가노이드를 유지하는 것입니다. 생존율 저하나 감염이 공동 배양 생존과 실험 결과를 저해하기 때문입니다. 우리는 유세포 분석에 집중했지만, 공동 배양은 염색, 영상 및 시퀀싱을 위해 수집할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 오가노이드-T 세포 공동 배양 시스템을 사용하여 CD8 거주 메모리 T 세포 분화를 연구하는 방법을 시연합니다. 이는 통제된 시험관 내 환경에서 T 세포 반응을 조사할 수 있게 하여, 여성 생식기 내 면역 반응을 이해하는 데 매우 중요합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 면역학
- 감염 생물학
- 세포 배양 기술
배경
- CD8 T 세포는 면역 반응에서 중요한 역할을 합니다.
- 거주 메모리 T 세포는 장기간 면역에 필수적입니다.
- 이러한 세포를 연구하는 기존 방법에는 한계가 있습니다.
- 오가노이드 모델은 생리학적으로 더 관련성 있는 환경을 제공합니다.
연구 목적
- CD8 T 세포 분화를 연구하기 위한 확장 가능한 시험관 내 시스템을 개발합니다.
- 감염이 T 세포 거주 및 기능에 미치는 영향을 평가합니다.
- 거주 메모리 T 세포 마커의 획득을 평가합니다.
사용된 방법
- 마우스로부터 CD8 T 세포를 분리합니다.
- 감염된 질 상피 오가노이드와 T 세포를 공동 배양합니다.
- T 세포 마커를 평가하기 위한 유세포 분석을 사용합니다.
- 시간에 따른 바이러스 복제와 T 세포 반응을 모니터링합니다.
주요 결과
- 오가노이드의 감염은 T 세포 축적으로 이어집니다.
- CD8 T 세포는 메모리 마커의 증가된 발현을 나타냅니다.
- 자극된 T 세포에서 사이토카인의 중요한 생산이 발생합니다.
- 이 방법을 통해 시험관 내에서 T 세포 행동을 상세하게 연구할 수 있습니다.
결론
- 이 프로토콜은 CD8 거주 메모리 T 세포를 효율적으로 연구할 수 있게 합니다.
- 감염의 맥락에서 T 세포 반응에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 이 접근 방식은 T 세포 연구에 대한 동물 모델에 대한 의존성을 줄일 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Modeling CD8 T cell differentiation within a physiologically relevant epithelial organoid system addresses a critical gap in immune target validation for mucosal barrier tissues. This in vitro co-culture platform enables mechanistic de-risking of epithelial-T cell interactions, supporting predictive confidence in early immunology discovery and translational research. The approach offers scalable, reductionist analysis of tissue-resident memory T cell (TRM) biology, directly informing portfolio decisions in immunotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epithelial-derived cues driving CD8 T cell differentiation.
- Supports functional validation of immune targets in a controlled, disease-relevant system.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables influencing TRM phenotype acquisition.
- Provides a platform for hypothesis-driven exploration of protective immunity mechanisms.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid-T cell co-cultures for downstream phenotypic and functional assays.
- Standardizes quantitative flow cytometry and cytokine readouts for reproducible immune profiling.
- Enables scalable screening of modulators affecting T cell residency and function.
- Supports assay development for compound evaluation in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mucosal tissue biology for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of immune targets by modeling infection-driven T cell responses.
- Supports biomarker discovery through quantitative analysis of TRM-associated markers and cytokines.
- Facilitates preclinical decision-making by providing mechanistic insights into tissue-specific immunity.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional immune target validation in a scalable in vitro format.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of epithelial signals in TRM differentiation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for immune phenotyping and cytokine analysis.
- Analytics: Delivers flow cytometry and ELISA-compatible readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models infection-driven immune responses in barrier tissues for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse epithelial and T cell sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture and analytical workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of immune targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, T cell isolation, and co-culture techniques.
- Demands access to flow cytometry, imaging, and ELISA infrastructure for quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of cell viability and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial and T cell sources with protocol optimization.
- Dependent on maintaining high viability of both organoids and T cells for reliable outputs.
