면역블로팅에 의한 Xenopus 난모세포 및 배아의 단백질 최적화 분석

동물의 일생 동안 황산염 결정은 정상적인 발달과 성체 유기체의 건강을 허용하는 지속적으로 발생합니다. 이러한 결정은 황산염 조절제에 언급되는 특정 단백질에 따라 달라집니다. 우리 연구의 목표는 이러한 중요한 조절자의 합성을 제어하는 메커니즘을 찾는 것입니다.

면역블로팅 및 Xenopus 난모세포 및 배아에 대한 자세한 개요를 제공하는 것 외에도 당사의 프로토콜은 항체 조달과 같은 이 모델 유기체에 공통적인 문제에 대한 통찰력을 제공합니다. Bicaudal C의 결합 및 억제 메커니즘에 대한 심층 연구를 통해 우리의 연구는 다른 번역 조절자를 비교할 수 있는 정보의 기초를 구축하는 데 도움이 되었습니다. 면역블로팅을 위한 세포 처리를 시작하려면 배아 또는 난모세포당 이중 탈이온수로 1배 농도로 희석된 냉각 세포 용해 완충액 10마이크로리터를 추가합니다.

미세유봉을 사용하여 얼음 위에서 샘플을 균질화합니다. 튜브를 벤치탑 원심분리기에 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 5, 000g에서 10분 동안 회전시켜 노른자 및 불용성 색소를 포함한 파편을 펠릿화합니다. 상청액을 깨끗한 1.5밀리리터 튜브로 옮겨 이송 중에 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.

수집된 상청액에 5% 중량 2-메르캅토에탄올이 보충된 동일한 부피의 2배 Laemmli 샘플 완충액을 첨가합니다. 혼합물을 섭씨 95도에서 100도에서 10분 동안 가열하여 단백질을 변성시킵니다. 이제 포장에서 4-12% bis-tris SDS 프리캐스트 젤을 제거하고 젤 바닥에서 스티커를 떼어냅니다.

젤을 버퍼 댐 반대편에 있는 전극 어셈블리에 삽입하고 전체 어셈블리를 수직 전기영동 탱크에 넣습니다. 그런 다음 전극 어셈블리와 탱크 바닥을 모두 Tris-MOPS-SDS 실행 버퍼로 채웁니다. 젤 빗과 피펫 실행 완충액을 웰에 부드럽게 제거하여 기포를 제거하고 완충액의 평형을 유지합니다.

이제 사전 염색된 단백질 표준물질 5마이크로리터를 첫 번째 웰에 로드하고 준비된 각 샘플 10마이크로리터를 나머지 웰에 로드합니다. 전기영동 탱크에 뚜껑을 덮고 전원 공급 장치에 연결합니다. 그런 다음 전압을 200볼트로 설정하여 전기영동을 시작합니다.

샘플-완충액 염료 전면이 겔을 빠져나가면 전기영동을 중지합니다. 전기영동이 완료되기 전에 전사 클립에 전사 샌드위치 조립을 시작합니다. 유리 베이킹 접시에 냉각된 전사 완충액을 채우고 조립하는 동안 모든 전사 재료를 이 완충액에 담그십시오.

검은색 반쪽이 바닥에 닿고 흰색 반쪽이 위를 향하도록 하고 클립이 왼쪽으로 열리도록 전사 클립을 접시에 놓습니다. 전사 클립의 검은색 절반에 하나 또는 두 개의 섬유 스펀지를 평평하게 놓습니다. 0.35mm 셀룰로오스 크로마토그래피 용지 두 장을 크기에 맞게 자른 후 스펀지 위에 하나를 놓습니다.

전기영동이 완료되면 전기영동 탱크에서 젤을 제거합니다. 젤 카세트 개방 레버를 사용하여 젤 플레이트를 조심스럽게 들어 올리면서 젤이 한쪽에 부착된 상태로 유지되도록 합니다. 젤 이형제를 사용하여 젤 상단에서 우물을 잘라냅니다.

플라스틱 카세트의 절반에 부착된 젤을 여과지 위에 놓고 나머지 카세트 절반을 제거하여 젤이 종이에 평평하게 유지되도록 합니다. 다음으로, 젤의 치수에 맞게 0.45마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인 조각을 자릅니다. 보호지에서 멤브레인을 제거하고 전사 완충액에 잠시 적신 다음 젤 위에 조심스럽게 놓습니다.

그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 두 번째 여과지를 놓습니다. 롤러를 사용하여 모든 기포를 부드럽지만 단단히 밀어냅니다. 여과지 위에 하나 또는 두 개의 추가 섬유 스펀지를 쌓아 샌드위치를 완성합니다.

전사 카세트를 닫고 단단히 고정하여 조립된 샌드위치를 밀봉합니다. 그런 다음 닫힌 전사 샌드위치를 클립이 위쪽을 향하도록 전사 코어에 삽입하고 클립의 검은색 면이 코어의 검은색 면을 향하도록 합니다. 전사 코어를 전기 영동 탱크에 넣습니다.

탱크에 아이스팩과 교반 막대를 추가하여 교반 막대가 자유롭게 회전할 수 있도록 합니다. 장치가 완전히 잠길 때까지 탱크에 냉각된 이송 완충액을 채우고 뚜껑을 위에 고정합니다. 장치를 전원 공급 장치에 연결하고 전극 색상을 일치시킨 다음 교반 막대가 회전하면서 1시간 동안 조건을 100볼트로 설정합니다.

전송이 완료되면 카세트를 조심스럽게 열고 샌드위치를 분해합니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 제거하고 젤과 접촉한 면을 표시합니다. 그런 다음 니트로셀룰로오스 멤브레인을 작은 용기에 넣어 바닥에 평평하게 놓습니다.

멤브레인을 퐁소 얼룩으로 완전히 덮고 로커에서 5-10분 동안 부드럽게 흔듭니다. 폰소 염색을 부은 후 과도한 얼룩이 제거되고 레인에 단백질 밴드가 보일 때까지 이중 탈이온수로 멤브레인을 여러 번 헹굽니다. 그런 다음 그림과 같이 멤브레인 차단, 항체 배양 및 세척 단계를 수행합니다.

2차 항체 배양 및 세척이 완료되면 멤브레인을 이미징할 준비가 된 것입니다. 어두운 방에서 필름 현상액을 켜고 예열하십시오. 멤브레인을 완전히 덮을 수 있을 만큼 큰 플라스틱 랩 두 개의 정사각형을 자릅니다.

집게를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 플라스틱 랩의 첫 번째 사각형 위에 앞면이 위로 향하도록 놓습니다. 1.5밀리리터 튜브에 동일한 부피의 강화 화학발광 루미놀과 강화제 시약을 혼합합니다. 그런 다음 혼합물의 약 1밀리리터를 사용하여 대부분의 멤브레인을 덮습니다.

플라스틱 랩을 사용하여 멤브레인을 부드럽게 조작하여 전체 표면이 고르게 코팅되도록 하고 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 집게로 멤브레인을 잡고 액체를 가볍게 털어내어 여분의 ECL 시약을 제거합니다. 멤브레인을 두 번째 사각형 플라스틱 랩 위에 놓고 멤브레인 위에 느슨하게 접은 다음 랩을 자동 방사선 촬영 카세트에 단단히 테이프로 붙입니다.

다음으로, 표시된 단계에 따라 어두운 방에서 자동 방사선 촬영 필름을 사용하여 멤브레인을 이미지화합니다. 원하는 단백질 시각화가 달성된 후 현상된 필름을 야광 마커에 정렬하고 이를 가이드로 사용하여 사전 염색된 단백질 표준의 위치를 필름에 표시합니다. 이미징이 완료되면 플라스틱 랩에서 멤브레인을 조심스럽게 제거하고 TBSTW에 담가 잔류 ECL 시약을 씻어냅니다.

멤브레인의 폰소 염색은 성공적인 단백질 전달을 확인했습니다. 내인성 B1 단백질은 난모세포 샘플에서 검출되지 않았지만 약 107킬로달톤에서 7기 및 10.5기 배아 샘플에서 명확하게 검출되었습니다. Bicc1 항체를 사용하여 모든 단계에서 주입된 샘플에서 더 작은 70킬로달톤 단백질 밴드가 검출되었으며, 이는 HA-Bicc1 C-말단 융합의 성공적인 발현을 나타냅니다.

HA 항체는 주입된 샘플에서만 동일한 70킬로달톤 밴드를 검출하여 융합 단백질에 대한 Bicc1 항체의 특이성을 확인했습니다. CNOT1 항체를 사용하여 모든 샘플에서 약 250 및 270킬로달톤의 두 개의 고분자량 밴드가 검출되었습니다. 54킬로달톤 DDX6 단백질의 발현은 모든 샘플에서 검출되었지만 10.5기 배아에서는 눈에 띄게 감소했습니다.