디지털 공간 프로파일링을 위한 보존된 형태와 RNA를 이용한 석회화된 동맥 준비 및 처리

공간 전사체학은 조직 내 공간 정보를 보존함으로써 단일 세포 RNA 시퀀싱과 대량 RNA 시퀀스 모두에 비해 이점을 제공합니다. RNAscope, 계산 해합성, 공개된 단일 세포 데이터셋과 같은 도구를 사용하여 세포 행동을 그 지적 및 유전자 프로필에 매핑하고 조직 생물학에 대한 통합적 관점을 구축할 수 있습니다. 이 기술은 폭발적으로 발전하고 있어.

2025년 5월 Nature에 실린 두 편의 논문이 공간 전사체학 연구에 초점을 맞추고 있습니다. PubMed를 차트로 보면 곡선은 더 가파릅니다: 2023년 약 150편, 2024년에는 거의 300편, 2025년에는 500편을 넘을 것으로 예상됩니다. 공간 전사체학은 암 생물학, 신경과학, 면역학, 발생생물학 등 여러 주요 연구 분야를 이미 재편했습니다.

하지만 혈관 생물학은 뒤처지고 있습니다. 동맥과 정맥의 이질성과 독특한 기하학적 구조는 조직 부착과 RNA 보존에 어려움을 줍니다. 또한, 진행된 혈관 병변은 석회화와 혈전증이 나타나 조직의 완전성을 더욱 저하시킵니다.

이 프로토콜은 선박형 구조를 위해 특별히 설계되었습니다. 또한 RNA, 칼슘 침착, 관심 세포 평가를 위한 비용 절감과 필요한 염색 과정을 줄이는 방법론도 포함합니다. 현재 다른 분야에 비해 혈관 중심 공간 전사체학 연구가 부족한 점을 고려할 때, 이 프로토콜은 비용 효율적이고 초보자 친화적으로 설계되어 혈관 연구자들이 공간 전사체학을 연구에 활용할 수 있는 접근성 도구를 제공합니다.

이 프로토콜은 임상 실험을 위한 대규모 코호트 샘플에도 잠재적으로 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 석회화된 동맥 조직의 신중한 취급, RNA 품질과 조직 형태를 보존하기 위한 석회화 특성 방법, ROI 선택 시 검증 및 지침을 위한 염색 기법, 그리고 준비된 슬라이드에 대한 최종 형태학적 표지 염색을 포함하여 디지털 공간 프로파일러 기기에서 처리할 준비가 되도록 하는 상세 절차를 설명합니다. 환자의 절단 표본에서 채취한 경골동맥(전경골, 후경골, 회음동맥을 포함)은 1% HEPES와 1% Pen-Strep을 포함한 DMEM에 보관되었습니다.

각 동맥은 매체와 함께 100밀리미터 페트리 접시로 옮겨집니다. 과도한 혈관 주변 결합 조직은 멸균 가위와 겸자를 사용해 제거하여 동맥벽만 남깁니다. 다듬은 동맥은 새로운 페트리 접시로 옮겨집니다.

접시 안에는 멸균 도마가 준비되어 있습니다. 동맥은 수술용 칼날로 1cm 단위로 절단됩니다. 각 동맥의 두 구간은 액체 질소에 담긴 냉동관에 급동되어 냉동 보존 및 향후 단백질 또는 RNA 작업을 위해 저장됩니다.

나머지 구간은 10% 중성 완충 포르말린이 들어 있는 15밀리리터 튜브에 넣어 4도에서 24시간에서 48시간 동안 고정합니다. RNA 안정화 용액 내 10% EDTA를 포함한 탈석화 용액을 준비하여 pH를 5.2로 조정합니다. 고정된 휴지는 PBS가 포함된 새로운 접시로 옮겨지고, 휴지를 잠시 세척합니다.

각 샘플은 탈석화 용액이 담긴 15밀리리터 튜브에 옮겨져 4도에서 72시간 동안 교반됩니다. 탈석화가 완료된 후, 샘플은 PBS를 사용해 5분간 부드럽게 저으며 두 번 세척합니다. 휴지는 카세트로 옮겨집니다.

카세트는 조직 프로세서에 삽입됩니다. 포르말린 처리는 최소 4시간 동안 진행됩니다. 시료 행렬에 따라 시간이 달라질 수 있습니다.

블록당 여러 동맥 구간이 배치됩니다. 블록은 파라핀으로 채워져 완전히 식힙니다. 슬라이드는 슬라이드 백에 제한된 조직 부위를 표시하여 준비합니다.

모든 세그먼트가 GeoMx DSP 기기에서 요구하는 제한 구역 내에 있는지 확인하세요. 블록에서 과잉 파라핀을 제거합니다. 블록들은 저프로파일 블레이드로 5마이크론 구간으로 분할됩니다.

조직 리본은 표시된 영역 안에 부착됩니다. DSP 실험에서는 블록당 최소 네 개의 직렬 섹션이 서로 다른 염색에 맞게 장착됩니다. 사용 전까지 4도 온도에서 보관하세요.

다음으로, RNAscope in-situ 하이브리다이제이션과 조직학적 염색이 연속 준비된 슬라이드에서 수행됩니다. 또한, 면역세포의 경우 CD45, 평활근세포의 알파-SMA와 같은 형태학적 표지로 염색된 또 다른 슬라이드 세트가 있습니다. RNAscope in situ 하이브리다이제이션 절차는 간단히 네 가지 주요 단계로 구성됩니다: 전처리로서의 슬라이드 베이킹, 표준 탈파라핀화 및 재수화, 표적 회수, 신호 증폭을 이용한 프로브 하이브리다이제이션, 그리고 RNA 시각화를 위한 염료 염색.

조직학적 검증을 위해 H&E 염색과 알리자린 레드 S 염색이 모두 시행되어 칼슘 침전물의 정확한 위치를 파악할 수 있습니다. 마지막으로, 표준 면역조직화학 프로토콜에 따라 형태학적 마커 염색을 수행하여 관심 세포를 식별하고 ROI 선택을 안내합니다. 본 연구에서는 두 가지 EDTA 기반 프로토콜을 비교하였는데, 하나는 10% EDTA 단독 72시간, 두 개는 동일한 시간 동안 10% EDTA 및 RNA 안정화 용액을 사용했습니다.

형태와 RNA 질은 RNAscope in-situ 하이브리드화를 통해 평가하였습니다. 두 방법 모두 혈관 구조는 보존되었으나, EDTA 및 RNA 안정화 용액 조합으로 처리된 슬라이드에서는 RNA 신호가 현저히 강한 것으로 나타났으며, 이는 RNA 안정화 용액이 전사체를 보호하는 반면 EDTA는 결정질 인산칼슘을 킬레이팅하여 RNase를 활성화하지 않고 점차 표본을 부드럽게 만든다는 것을 나타냅니다. RNA 보존 전략이 최적화되고 품질이 확인된 후, 우리는 헤마톡실린과 에오신, 알리자린 레드 S를 이용한 칼슘 침착을 위한 조직학적 염색 단계를 시연합니다. 알리자린은 이온 칼슘 염에 선택적으로 결합하여 주황색에서 벽돌색으로 색조를 변화시키며, 미세 및 거대 석회화를 민감하게 강조하지만, H&E보다 세포 및 세포 외 기질 세부 정보를 제공하지는 않습니다.

두 가지 염색을 모두 사용하면 구조적·조성 정보를 극대화할 수 있습니다. 형태학적 마커 염색 후, 슬라이드는 GeoMx 플랫폼에서 스캔됩니다. 항체 CD45는 면역 세포를 표시하고, 알파-평활근 액틴은 배지에 풍부한 혈관 평활근 세포를 표지합니다.

선정된 ROI는 약 100개에서 150개의 핵을 포함하며, 적절한 RNA 수량을 갖추게 됩니다. ROI는 석회화 부위 인접 및 거리 부위에 배치하여 경골 동맥 내측 석회화와 관련된 공간적 유전자 발현 패턴을 비교하였습니다. 수시간에 걸친 처리 과정에서 일부 조직 손실이 있었음에도 불구하고, 각 동맥 절편에서 여러 적합한 ROI가 확인되었습니다.

결론적으로, 이 워크플로우는 공간 전사체학 연구를 위한 검증, 염색 및 ROI 선택을 통한 석회화된 동맥 조직 취급 및 탈석화를 포함합니다. 특히, H&E와 칼슘 특이적 알리자린 염색을 결합하면 혈관 석회화의 정확한 위치를 보장하고 ROI 배치에 대한 구조 및 조성 정보를 극대화합니다. RNAscope 분석 결과, 탈석화된 동맥 절편은 충분한 RNA로 대체로 온전하게 유지됩니다.