Name: 방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 Shrinky-Dink 몰드를 이용한 배아체 형성 방법으로 정확한 세포 수 제어와 줄기세포 분화 연구에 활용하세요. 이 기술은 기존 행잉 드롭법보다 간단하고 재현성이 높습니다.

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우리는이 작품의 지원 CIRM 감사하고 싶습니다. 셀 라인은 넉넉한 마운트시나이 병원, 토론토, 온타리오에서 박사 Andras 나지에서 기증되었다.

1. Shrinky - 딩크 몰드 만들기 <ol><li> 좋은 정의 프린터를 사용 shrinky - 딩크 시트에 원하는 패턴을 인쇄합니다. </li><li> 163에서 베이크 shrinky - 딩크 시트 ° C 약 10 분, 또는 때까지 대해 전적으로 축소하고 정기적인 모양을 인수하는 데. </li><li> shrinky - 딩크의 금형이 냉각되면, 이소프로판올 욕조에서 잠수함 그것은 전체 표면은 거의 덮여 때까지. </li><li> 신중하게, 금형을 통해 몇 가지 아세톤을 스프레이하고 컨테이너 몇 번 흔들. 아세톤의 초과를 씻고 shrinky - 곰팡이가 깨끗해 보여요 때까지이 단계 몇 번 반복해야 더 이소프로판올 추가합니다. </li><li> 남아있는 유기 용매 씻어 10 분 정도 증류수에 담가 곰팡이. </li><li> 에어 shrinky - 곰팡이 청소. 163에서 5 분 동안 그것을 다시 열 ° C. 이것은 남아있는 용매를 증발 압축 잉크 및됩니다. </li></ol> 2. PDMS microwells 만들기 <ol><li> 10시 1분 PDMS / 치료 에이전트 혼합물을 준비하고, 몇 분 동안 적극적으로 선동. </li><li> 작은 페트리 접시에 넣어 shrinky - 딩크 금형. 그것은 금형 표면 2분의 1에 대한 cm에 도달할 때까지 PDMS 혼합물을 붓고. </li><li> PDMS 혼합물에서 모든 거품을 제거하기 위해 진공 종 아래 플레이스 요리. </li><li> 70 오븐에 넣어 요리 ° C, 하룻밤. </li><li> 금형에서 고체 PDMS를 차단하고 단지 압력을 적용하여 유리 슬라이드에 바인딩합니다. </li><li> 그것이 PDMS 사이 incrusted 잉크 잔류물을 가지고 있기 때문에, 첫번째 microwell 칩 폐기하십시오. </li><li> 잉크 무료이며 더 정의된 모양을 가지고 두 번째 칩을 생산하기 위해이 절차를 반복합니다. </li><li> 청소는 microwell 칩 70 % 에탄올 솔루션을 사용합니다. 그것을 소독하기 위해 10 분 동안 자외선 광원 아래로 놓으십시오. </li></ol> 3. microwells에서 트래핑 세포 <ol><li> 세포를 카운트하고 원하는 농도 (당신이 싶은 얼마나 많은 우물의 초기 세포에 따라)에 문화 미디어에서 그들을 희석. 예를 들어, 잘 당 약 10-15 세포 (평균 = 11, SD = 5.4, 로딩 속도 = 93%)하기 위해서, 우리는 8 농도 × 10 4 세포 / ML를 사용합니다. 17 × 10 4 세포 / ML의 농도에 대해서는 안정적으로 잘 당 25의 사이 35 세포를 (평균 = 27.17857 SD는 = 7.7, 로딩 속도 = 100 %)받을 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 확정 PDMS 기반을 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브의 microwell 칩 장소. </li><li> 세포 솔루션의 2JDP ML에 대한 추가합니다. </li><li> 5 760 RPM 분만에 4 ° C.위한 원심 분리기 </li><li> 초과 솔루션 아웃 Pipet 조심스럽게 PBS 1X 솔루션 microwell 씻는다. </li><li> 원심 분리기 튜브의 칩을하면서 조심하고, 작은 페트리 접시에 microwell를 배치합니다. </li><li> 1 X PBS 솔루션을 사용하여 셀 초과 씻으십시오. </li><li> 물론 당 세포의 의도 번호를 확인할 수 거꾸로 현미경 microwell 칩을 놓으십시오. </li><li> 부화 microwell 표준 조건에서 세포를 포함하는. <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="그림 - 01" width="350" height="183" /></li></ol> 4. 세포 배양 <ol><li> 연구실에 정상 EB 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 천천히 챔버의 측면에서 매체를 변경, microwell에있는 세포를 방해하지 마십시오. </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

우리는 microfabricated 웰스 (Shrinky - Dinks에서 성형)에 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며, 우리가 석판술의 필요성을 사전에 제거하다 때문에 아무 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 embryoid 기관의 수와 크기를 변경할 수있는 microwells의 크기뿐만 아니라 세포 / 웰스의 농도를 다를 수 있습니다.

KO DMEM : 40.8ml, 81.6ml 15 % KSR : 7.5ml, 15ml 1X 펜 - Strep : 0.5 ML, 1ml 2mM L - 글루타민; (100ml 50ml 대비 총 미디어 :) mESC 미디어 (맥클로스키 실험실 프로토콜)에 대한 0.5 ML, 1ml NEAA : 0.5 ML, 1ml 평범한 : 100ul, 200ul BMP - 4 (10ng/ml) : 50ul, 100ul 희석 BME :. 50ul, 100ul (PBS와 주사기 필터 5ml에 살균 필터 BME의 35ul 추가 소독 삭제 이주 후에. 솔루션에 최종 농도는 0.1 MM입니다)

방울을 공중 shrinky - 딩크 : embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid 단체 (EB)는 배아 줄기 세포 집합체입니다. 이러한 집합체를 만드는 가장 일반적인 방법은 매달려 드롭 방식, 잘 접시에 세포의 임의의 숫자를 pipetting의 힘드는 접근이다. 서로의 가까이에 강제 줄기 세포 사이의 상호 작용은 EBS의 생성을 촉진. 우물의 각 미디어가 수동으로 매일 교환해야했기 때문에, 이러한 방식은 수동으로 집약적이다. 동일한 조건에서 양식 때 또한, 셀 셀, 셀 용해 계수 상호 작용, 산도, 그리고 산소의 가용성을 포함한 환경 매개 변수 EB 크기의 기능을 수 있기 때문에, 전통적인 매달려 방울에서 얻은 세포 집단도 크게 다를 수 있습니다. 최근 연구는 실제로 집계를 형성하는 세포의 초기 숫자가 줄기 세포 분화에 중요한 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해, 간단한 신속하고 확장 가능한 문화 방식을 개발했습니다. 마지막으로, 이러한 전지는 더 이상 분석 및 실험을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 실험실 의무이며 전용 장비를 필요하지 않습니다. 우리는 붉은 형광 마우스 세포 라인을 (129S6B6 - F1)를 사용 embryoid 시체를 작성하여이 방법을 보여줍니다.

우리는 microfabricated 우물로 세포의 미리 정의된 숫자를로드하고 embryoid 몸 개발을 위해 그들을 유지하기 위해 간단하고 빠른 방법을 보여줍니다.

방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

배아체(Embryoid bodies, EB)는 배아줄기세포의 응집체입니다. 이러한 응집체를 생성하는 가장 일반적인 방법은 현탁 적하법(hanging drop method)으로, 이는 많은 노동력이 소요되는...

엠브로이드 바디(Embroid bodies)는 배아줄기세포의 응집체입니다. 이러한 응집체를 만드는 가장 일반적인 방법은 행잉 드롭(hanging drop)법입니다. 이는 임의의 세포 수를 웰 플레이트에 피펫팅하는 노동 집약적인 방식입니다.배지와 각 웰 플레이트를 매일 수동으로 교체해야 하므로 이 과정은 노동 집약적입니다. 또한, 최근 연구들에 따르면 응집체를 형성하는 초기 세포 수가 줄기세포 분화에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 방법을 사용해서는 세포 수를 미리 결정할 수 있는 방법이 없습니다.이 영상에서는 배아체(embryoid body) 발달을 위해 미세 가공된 웰(well)에 다양한 수의 세포를 간단하고 빠르게 로딩하는 방법을 보여드립니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 머세드 공과대학 Michelle K 교수님 연구실의 Jonathan Pagan입니다. 그리고 저는 같은 연구실의 Jesus Luna입니다. 오늘은 원심분리를 통해 미세 가공된 웰에서 배아체를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다.본 절차는 마이크로 장치 제작, 줄기세포 로딩 및 줄기세포 배양 단계로 구성됩니다. 이제 시작하겠습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 고해상도 프린터를 사용하여 shrinky dink 몰드를 제작하는 것입니다.슈린키 딩크(shrinky dink) 시트에 원하는 패턴을 인쇄합니다. 다음으로, 슈린키 딩크 시트를 160 °C에서 약 10분 동안, 또는 완전히 수축하여 일정한 모양이 될 때까지 굽습니다. 수축된 잉크 몰드를 2분 동안 식혀 만졌을 때 차가운 상태가 되도록 합니다.표면 전체가 겨우 잠길 정도로 이소프로판올 용액에 담급니다. 수축 잉크 몰드를 이소프로판올에 담근 후, 몰드 위에 아세톤을 조심스럽게 뿌리고 용기를 몇 번 흔듭니다. 그 다음, 과잉의 아세톤을 씻어내기 위해 이소프로판올을 더 추가하며, 수축 잉크 몰드가 깨끗해 보일 때까지 이 단계를 몇 번 반복합니다.다음으로, 남은 유기 용매를 씻어내기 위해 몰드와 증류수를 10분 동안 담가 둡니다. 물에 담근 후, 압축 공기를 사용하여 shrinky ink 몰드를 공기로 세척하고 160 °C에서 약 5분 동안 다시 가열합니다. 이렇게 하면 잉크가 압착되고 남은 용매가 증발합니다.이제 PDMS 마이크로웰 제작 단계로 넘어가겠습니다. 줄기세포를 배양하여 배아체(embryoid body)를 형성하는 데 사용할 PDMS 마이크로웰을 생성합니다. PDMS와 경

shrinky-dink-hanging-drops-simple-way-to-form-culture-embryoid

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 매달려 드롭 방법을 사용하여 embryoid 기관에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 차별에 수행하는 방법을 보여줍니다.

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

우리는 세포 - 세포 상호 작용의 차이를 수치 3D 조직 같은 spheroids 및 잠재적인 응용 프로그램을 생성하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

이 동영상은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 대뇌 오가노이드를 생성하는 분석을 보여줍니다. 인간 iPSC는 배아체(EB)를 형성하도록 유도됩니다. EB는 유도 배지를 사용하여 고분자 골격 위에서 배양되어 신경 줄기 세포, 전구 세포 및 미성숙 뉴런으로의 분화를 촉진합니다. 마지막으로, EB는 매트릭스에 삽입되어 대뇌 오가노이드 형성을 위한 유지 배지로 전달됩니다.

유도 만능 줄기 세포 유래 대뇌 오가노이드 생성

이 동영상은 행잉 드롭 배양 기법을 사용하여 뉴런 볼을 생성하는 과정을 보여줍니다. 매달린 방울 내에서 세포는 바닥을 향해 이동하여 3차원 구조로 자체 조립되어 신경생물학 연구에 사용할 수 있는 뉴런 볼을 형성합니다.

Hanging Drop Culture 기법을 이용한 뉴런 볼(Neuron Ball) 개발

이 비디오는 행잉 드롭 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포(mESC)와 배아체(EB)의 분화를 보여줍니다. mESC를 매달린 방울에 현탁시키고 배양하면 세포가 응집하여 EB를 형성하고, EB는 레티노산(RA)이 보충된 분화 배지를 사용하여 신경 전구 세포(NPC)로 더욱 분화됩니다.

Hanging Drop 방법에 의한 마우스 배아 줄기 세포로부터 신경 전구 생성

이 비디오는 배아의 육안 시각화를 개선하기 위해 측면 소프트 라이트 조명 기술을 활용하여 대뇌 오가노이드 배양 중 배아의 조작 및 전달을 용이하게 하는 방법을 보여줍니다. 소프트 라이트 조명의 설정, 매체 변화 및 배아체 전달 방법, 대뇌 오가노이드 발달을 위한 배아체의 신경 분화를 유도하는 절차를 설명합니다.

측면 소프트 라이트 조명을 사용하여 대뇌 오가노이드 배양을 최적화하는 기술

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.

측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진

본 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 유래한 대뇌 오가노이드의 재현 가능한 생성, 유지 및 노화를 위한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법은 장기간 대뇌 오가노이드를 배양하고 성숙시킬 수 있어 뇌 노화 및 노화 관련 병인과 관련된 과정의 모델링을 용이하게 합니다.

노화 연구를 위한 iPSC 유래 뇌 오가노이드의 장기 배양을 위한 강력한 조직 제작

여기에서는 single-cell 및 single-nucleus RNA sequencing을 사용하여 인간 뇌 오가노이드의 생성 및 다운스트림 분석을 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다.

Generation and Downstream Analysis of single-cell and single-nuclei transcriptomes in brain organoids(뇌 오가노이드에서 단세포 및 단핵체 전사체의 생성 및 다운스트림 분석)

배우세요 Shrinky-Dink 몰드를 이용한 배아체 형성 방법으로 정확한 세포 수 제어와 줄기세포 분화 연구에 활용하세요. 이 기술은 기존 행잉 드롭법보다 간단하고 재현성이 높습니다.

방울을 공중 Shrinky - 딩크 : Embryoid 기관 폼 문화하는 간단한 방법

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