면역 세포 프로파일링을 위한 괴사성 소장결장염 및 Lamina Propria 분리의 신생아 마우스 모델

저희 연구는 의학적 취약한 영아에게 영향을 미치는 괴사성 장염(Necrrotizing enterocolitis)에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 NEC에서 면역 반응에 관여하는 기전을 밝히고, 질병의 조기 진단 및 예방을 위한 전략을 개발하는 것을 목표로 합니다. 신생아 NEC에서 장 면역 세포 반응을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 저희 프로토콜은 유세포분석을 통해 고유 면역 세포를 분리하여 분석하는 방법을 시연하여 이 공백을 메웁니다.

우선, 괴사성 장대장염 전산(NEC) 환자로부터 배양한 장내 박테리아 배양을 취득하세요. 실험 0일차 오후 3시에 20마이크로리터 분량의 배양물을 15밀리리터 배양관에 피펫팅하여 2밀리리터 루리아-베르타니 육수를 담습니다. 박테리아 배양물을 37도 섭씨에서 1G로 설정된 궤도 셰이커에서 16시간 배양하며, 튜브 뚜껑이 통풍된 상태로 유지되도록 합니다.

동시에 2밀리리터의 루리아-베르타니 육수를 포함한 두 번째 배양관을 배양하여 오염 여부를 검사합니다. 다음 날 오전 7시, 밤새 배양한 박테리아 배양액 125마이크로리터를 25밀리리터의 루리아-베르타니 육수를 담은 통풍구 뚜껑이 있는 T75 세포 배양 플라스크에 피펫 주입합니다. 총 4개의 T75 플라스크를 준비하고, 1G로 설정된 궤도 셰이커에서 37도 섭씨에서 2시간 동안 세운 상태로 부양하세요.

실험 1, 2, 3일 오전 9시에, 멸균 50밀리리터 원심분리관에 16밀리리터 유아분유와 8밀리리터 강아지 우유를 혼합하여 분유 혼합물을 준비합니다. 펠릿으로 된 박테리아 배양물을 담은 두 개의 50밀리리터 원심분리관에서 상원액을 제거한다. 두 펠릿 각각을 준비된 조제 혼합물 2밀리리터에 완전히 재현탁하세요.

그 후 두 개의 재현탁 혼합물을 남은 조제액에 옮겨 총 24밀리리터의 NEC 조제를 만듭니다. 6개의 50밀리리터 원심분리관 6개에 6개의 급식 시간 표시를 하세요. 6개의 라벨이 붙은 튜브 각각에 NEC 포뮬러 4밀리리터를 피펫으로 주입하세요.

다음으로, 5밀리그램/밀리리터의 일회용 지다당류 육수 6개를 준비하여 20도 섭씨의 저결합 마이크로 튜브에 보관합니다. 먹이기 직전에 지지다당류 알리코트 하나를 녹이고 15초간 소용돌이로 돌립니다. 계산된 지질다당류의 부피를 4밀리리터 NEC 포뮬러 튜브에 넣고 피펫으로 잘 섞습니다.

준비된 NEC 포뮬러를 1밀리리터 주사기에 채우고 신생아 PICC 라인에 연결하세요. NEC 분유를 경구 개비지로 각 강아지에게 투여하려면 목 밑의 느슨한 피부를 부드럽게 고정하고 강아지를 똑바로 세워 주세요. PICC 라인의 삽입 거리는 입 모서리에서 위 우유 점의 상단까지의 거리와 같습니다.

PICC 라인의 최적 삽입 지점은 영구 마커로 표시해야 합니다. 겸자를 사용해 PICC 라인을 구강인두로 유도하여 위로 내려가세요. 저항이 발생하면 PICC 라인을 제거하고 재배치한 후 재삽입을 시도하세요.

NEC 분유 80마이크로리터를 천천히 위에 투여하세요. 수유 중에 흡인 징후가 있는지 관찰하세요. 수유 후에는 PICC 라인을 제거하고 새끼가 호흡이 힘들거나 구토가 있는지 관찰하세요.

역류가 발생하면 보풀이 적은 실험실 용으로 강아지의 입과 코를 닦아주세요. 모든 먹이 시간대에서 먹이 주기를 반복하세요. 실험 4일째에는 안락사한 신생아 쥐의 장 조직을 채취합니다.

가위로 장을 세로 잘라 열고, 1-1.5센티미터 간격으로 가로로 절단합니다. 장 구간을 15밀리리터 원심분리관에 넣고, 10밀리리터의 소화 전 용액을 얼음 위에 냉각시킨 상태로 옮깁니다. 그 후 37도 섭씨에서 20분간 연속 회전시키며 관을 배양하여 조직 해리를 시작하세요.

튜브를 부드럽게 휘저어 느슨해진 조직을 떼어낸 후, 내용물을 50밀리리터 원심분리기 튜브 위에 올려놓은 100마이크로미터 셀 체로 부어줍니다. 남은 조직 조각을 10밀리리터의 소화액을 37도까지 예열한 새로운 15밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다. 샘플을 37도 섭씨에서 40분간 연속 회전시키며 배양합니다.

그 후 내용을 자동 조직 해리 튜브로 옮깁니다. 프로그램을 시계 방향과 반시계 방향으로 번갈아 15초씩 네 번 회전 주기로 실행하세요. 해리가 완료되면 해리 튜브 내 세포 부탁액을 부드럽게 소용돌이로 돌리고, 300G에서 4도에서 5분간 원심분리합니다.

펠릿을 흔들지 않고 상정액을 조심스럽게 흡입하세요. 세포를 1밀리리터의 얼음 차가운 형광 활성화 세포 분류 완충제에 재현탁합니다. 50밀리리터 원심분리기 튜브 위에 100마이크로미터 셀 체를 올려놓습니다.

재현탁된 세포를 체에 옮기고 2밀리리터의 차가운 형광 활성화 세포 분류 버퍼로 세척합니다. 분리된 세포를 세고 트리판 블루나 생존 염료를 사용해 생존 가능성을 평가합니다. 플로우 사이토메트리를 위해 원하는 부피를 300G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다.

NEC 처리군에서 댐 영양 대조군에 비해 생존율이 유의미하게 감소하는 것이 관찰되었습니다. NEC 마우스의 대장 검사에서는 건강한 대조군과 비교했을 때 팽창, 공기 축적, 장 기폐증 등 NEC의 특징적인 특징들이 나타났습니다. 헤마톡실린과 에오신 염색 검사는 NEC 마우스에서 조군의 온전한 융모에 비해 반발적인 모낭 파괴와 장 구조 붕괴를 드러냈습니다.

NEC 그룹에서 IL1B, CXCL2, LCN2 메신저 RNA의 발현이 대조군보다 유의하게 높았다. 장 내의 전유층 내 총 CD45+면역 세포는 NEC군과 대조군 간에 유의한 차이가 없었습니다. 대식세포 수치는 대조군에 비해 NEC 장에서 유의하게 높았다.

NEC 마우스는 다른 면역 아형에 비해 특히 단핵구와 대식세포의 골수계 세포 비율이 증가하는 것을 보였습니다. 단세포 다중체학 접근법은 NEC에서 면역세포 신호를 밝혀내어 기전과 잠재적 바이오마커에 대한 새로운 통찰을 제공하고 있습니다. NEC를 모델링하는 것은 이 질환이 다인성 질환이기 때문에 어렵습니다.

신생아 마우스에서 인간의 장 환경, 면역 반응 및 미생물 영향을 재현하려면 세심한 최적화가 필요합니다. 우리 모델은 인간 유래 마이크로바이옴, 저산소증, 분유 수유를 통합하여 신생아 마우스의 면역 세포 프로파일링에 생리학적으로 적합하게 만듭니다.