아르보바이러스에 대한 항체 반응 검출을 위한 다중 혈청학적 분석

우리 연구실에서는 감염병에 대한 면역 반응을 측정하여 인구 내에서 전파되는 방식을 더 잘 이해하고 있습니다. 우리 분야의 최근 발전은 다중 분석으로, 최소한의 부피로 단일 반응으로 여러 항체를 측정할 수 있게 해줍니다. 우선, 8개의 96 깊이 웰 플레이트를 확보하세요.

각 플레이트에는 팁 콤, 인산나트륨, 트리톤 용액, 설포-NHS, 일기성 용액, 항원 용액을 추가하여 준비합니다. 자동 프로세서에서 결합 사이클을 설정하려면 기계를 전원하고, 소프트웨어를 사용해 프로토콜 매개변수를 설정하세요. 판을 기계의 지정된 슬롯에 넣은 후 프로토콜을 선택한 후 사이클을 시작하고, 제조사 지침에 따라 판을 내리고 기계를 끕니다.

8번 판에 갈색 펠릿으로 보이는 구슬이 있는지 시각적으로 확인해 보세요. 플레이트 8에서 구슬 몇 개를 개별 1.5밀리리터 튜브로 옮겨 보관하세요. 결합된 비즈는 사용 전까지 4도 섭씨에서 보관하세요.

구슬을 세기 위해, 결합된 구슬들을 철저히 소용돌이로 세세요. 10마이크로리터를 셀 카운팅 챔버로 옮긴 후, 제조사의 지침에 따라 밀리리터당 구슬 수를 측정하세요. 셀 카운터에 이미지를 시각화하여 집계를 확인하세요.

플레이트 레이아웃을 세팅하세요. 희석된 샘플을 사용하고, 별도의 비결합 플레이트에서 PBT 버퍼에 표준으로 투여합니다. 결합된 비즈를 30초간 완전히 소용돌이로 섞은 후, 최소 60초 이상 소닉테이션을 하세요.

이제 충분한 비드 항원 부피를 원심분리관으로 옮기고 PBT 버퍼로 부피를 조절합니다. 프리믹스를 충분히 섞으세요. 프리믹스 50마이크로리터를 이미징 마이크로플레이트에 분배한 후, 희석된 샘플 50마이크로리터를 이미징 마이크로플레이트의 구슬에 피펫팅한 후 플레이트 셰이커에서 혼합합니다.

플레이트를 실온에서 60초간 자석 랙에 올려놓으세요. 플레이트를 선반에 단단히 고정한 후 상청액을 버리세요. 적절한 양의 PBT 완충액과 함께 희석된 2차 항체 용액을 준비합니다.

이미징 플레이트의 세척된 구슬에 항체 50마이크로리터를 추가하세요. 접시를 셰이커에 15분간 실온에서 배양한 후 PBT로 세 번 더 세척합니다. 플레이트를 형광 리더기에 삽입한 후 프로토콜을 설정하고 저장하세요.

ORPAL 표준 풀에서 최적의 농도로 검사된 선정된 아르보바이러스 항원에 대해 항체 반응의 선형성이 확인되었습니다. 수동과 세 가지 자동 결합 방법을 비교했을 때 항체 반응의 평행 선형성이 관찰되었습니다. 각 항원과 대조군에 대해 19개의 서로 다른 플레이트에서 얻은 중앙값 형광 강도 값은 평균 범위 내에 있었습니다.

ORPAL 표준 풀을 사용한 다중화 분석과 단일 분석에서 얻은 중앙 형광 강도 값 사이에 강한 상관관계가 관찰되었습니다. 세네갈 코호트에서는 Chick VVLP에 대한 항체 반응에서 명확한 이중분포가 관찰되었고, DENV1 NS1과 RVFV NP에서도 미묘한 이중분변이 관찰되었습니다. 우리는 혈청학적 검사가 여러 아르보바이러스에 대한 항체를 동시에 측정할 수 있음을 보여주었습니다. 다양한 아르보바이러스에 대한 다중 반응을 측정하는 검증된 검사법은 아프리카 전역에서 이들 바이러스의 전파를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

저희 프로토콜은 다중화 분석용 시약 준비에 있어 큰 시간 절약과 재현성을 제공합니다.