Name: 배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 기능화된 나노바디를 사용한 HeLa 세포에서의 엔도사이틱 수송 생세포 이미징 방법입니다. 이 기법은 막단백질 역수송 경로를 정량 분석하여 세포 내 물질 이동 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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<table><tbody><tr><td>항GFP 항체&nbsp;</td><td>시그마-올드리치</td><td>118144600001</td><td>제품은 시그마-알드리치에서 유통하지만, 제조는 로슈에서 담당합니다</td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 접시</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>항액틴 항체</td><td>EMD 밀리포어 &nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>항-HA 항체</td><td>실험실에서</td><td>12CA5 하이브리도마로 만들어졌습니다</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His6 항체</td><td>베틸 연구소&nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>항-T7 항체&nbsp;</td><td>베틸 연구소&nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) 유능&대장균</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이하이드레이트</td><td>메르크 밀리포어</td><td>102382</td><td>멸균수에 녹임, 재고는 1M</td></tr><tr><td>카르베니실린 이나트륨 염</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>멸균수에 녹인 경우, 스톡은 100 mg/mL입니다</td></tr><tr><td>쿠매시-R (브릴리언트 블루)</td><td>시그마-올드리치</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-비오틴</td><td>시그마-올드리치</td><td>B4501</td><td>멸균 500 mM NaH2PO4 또는 DMSO에 용해됨</td></tr><tr><td>일회용 PD10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 글루타맥스-I</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고혈당, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>멸균수에 녹아</td></tr><tr><td>둘벡코 인산염 완충 식염수(DPBS) 2+/Mg2+</td><td>시그마-올드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청(FBS)</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>필트로푸르 S, PES, 포렌그르&둠; &szlig; e: 0.45 & 마이크로; m</td><td>사르스테트</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD 형질전환 시약</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립 (No. 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티마우스 HRP</td><td>시그마-올드리치</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-래빗 HRP</td><td>시그마-올드리치</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>그의 버퍼 키트</td><td>키트비아</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>그의 GraviTrap 칼럼</td><td>키트비아</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-슬라이드 4 잘, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>이비디</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>멸균수에 녹임, 재고는 1M</td></tr><tr><td>카나마이신 황산염</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>멸균수에 녹인 경우, 스톡은 100 mg/mL입니다</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임&nbsp;</td><td>시그마-올드리치</td><td>18037059001</td><td>제품은 시그마-알드리치에서 유통하지만, 제조는 로슈에서 담당합니다</td></tr><tr><td>육수화마그네슘 클로라이드</td><td>메르크 밀리포어</td><td>105833</td><td>멸균수에 녹임, 재고는 1M</td></tr><tr><td>미니-프로티언 TGX 젤, 4-20%, 15웰</td><td>바이오-래드</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>수정된 헬라 교토</td><td>실험실에서</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha 유능&nbsp; 대장균</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 준비</td><td>마셰리-나겔 &nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>바이오콘셉트&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>40% DMSO 60% 이소프로판올에 용해, 500 mM 스톡</td></tr><tr><td>피닉스 암포 세포주</td><td>놀란 연구소</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌 (헥사디메트린 브로마이드)</td><td>시그마-올드리치</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>푸로마이신</td><td>인비보젠</td><td>앤트-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨과 nbsp;</td><td>메르크 밀리포어</td><td>106404</td><td>멸균수에 녹은 상태, 재고는 5M</td></tr><tr><td>나트륨 피루브산&nbsp;</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>트랜스-블롯 터보 팩, 미니</td><td>바이오-래드</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물&nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

다양한 세포 내 구획으로의 역행성 단백질 트래피킹을 조사하기 위해 우리는 최근 세포 표면에서 재조합 융합 단백질을 표지하고 추적하기 위한 항-GFP 나노바디 기반 도구를 확립했습니다17. 여기에서 우리는 이러한 유도체화된 나노바디의 박테리아 생산을 설명하고 살아있는 세포 이미징에 의한 엔도사이틱 흡수를 모니터링하는 데 있어 유용성을 입증합니다. 골지체 상주 형광 리포터와 함께 이 프로토콜은 선택된 화물 단백질의 트랜스 골지체 네트워크(TGN)로의 역행 수송을 실시간으로 정량적으로 연구할 수 있는 강력한 플랫폼을 제공합니다.
우리는 표준 분자 복제 기술을 사용하여 공통 모듈식 아키텍처를 공유하는 뚜렷한 기능화된 항-GFP 나노바디 모음을 생성했습니다17. 현재 연구는 형광 변이체 VHH-mCherry에 초점을 맞추고 있지만, 이 도구 세트의 다양성을 설명하고 향후 응용 분야의 잠재력을 강조하기 위해 추가 유도체화된 나노바디도 포함합니다. 당사의 가장 기본적인 구조인 VHH-std(표준의 경우 표준)는 VHH 도메인, 항체 기반 검출을 위한 T7 및 HA 에피토프, 정제를 위한 C-말단 헥사히스티딘(His6) 태그, 효소 비오티닐화 및 고친화성 스트렙타비딘 기반 풀다운 분석을 가능하게 하는 비오틴 수용체 펩타이드(BAP) 서열로 구성됩니다(그림 1A). 이 핵심 설계에서 생화학적 분석, 고정 및 살아있는 세포 이미징, 전자 현미경을 통해 엔도사이틱 및 역행 트래피킹의 연구를 용이하게 하기 위해 다양한 나노바디 유도체가 개발되었습니다.
엔도사이틱 수송의 생세포 이미징을 위해 GFP와 구별되는 여기 및 방출 스펙트럼을 가진 형광단을 통합하는 형광 항-GFP 나노바디를 설계하여 형광 현미경 검사 중 최적의 스펙트럼 분리를 보장했습니다. IPTG 유도 대장균 의 우수한 접힘 특성과 잘 특성화된 광물리학적 특성을 기반으로 mCherry를 형광 태그로 선택했습니다. 단량체 적색 형광 단백질(mRFP)과 같은 다른 적색편이 형광단도 원칙적으로 적합한 대안이 될 수 있지만 mCherry는 이 시스템에서 특히 견고하고 효과적인 것으로 입증되었습니다.
VHH-mCherry보다 다른 기능화된 나노바디의 잠재력은 무엇입니까? 원형질막에서 트랜스골지체(TGN)로의 단백질 트래피킹을 조사하기 위해 우리는 TGN과 트랜스골지수조에만 존재하는 TPST의 구획 특이적 국소화를 활용했습니다. 이를 위해 우리는 쥐 프로콜레시스토키닌29에서 파생된 탠덤 티로신 황산화 모티프(2xTS)로 VHH-std를 수정하여 이러한 구획에 도착하는 화물의 생화학적 판독을 가능하게 했습니다. VHH-std와 mCherry의 융합은 고정 또는 살아있는 세포 이미징에 의한 역행 수송의 직접적인 시각화를 허용하는 반면, APEX230 과 같은 과산화효소를 사용한 기능화는 전자 현미경, 표적 세포화학적 절제 또는 근접 기반 비오티닐화 분석에 의한 미세구조 국소화를 허용합니다. 또한, 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위를 나노바디 스캐폴드에 통합하면 내재화된 나노바디와 표면 결합 나노바디를 구별할 수 있는 생화학적 수단이 제공됩니다(그림 1A). 우리는 이전에 나노바디 결합 EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP17의 재활용 동역학을 모니터링하기 위해 VHH-tev 구조물을 사용했습니다. 세포 표면에서 나노바디 태그 수용체의 재출현은 재조합 TEV 프로테아제를 세포외에 적용함으로써 쉽게 감지할 수 있으며, 그 결과 나노바디의 C-말단 에피토프 카세트가 특이적으로 손실됩니다. 유사하게, 여기에 제시된 mCherry 기능화된 나노바디 VHH-mCherry 내에 TEV 절단 부위를 포함하면 살아있는 세포 이미징에 의한 EGFP 리포터 재활용의 동적 평가가 가능합니다. 추가 형광단, 효소 태그 또는 번역 후 변형을 위한 서열 모티프와 같은 대체 단백질 도메인을 사용한 기능화는 SpeI 및 EcoRI 제한 부위에 의해 원하는 삽입물을 VHH-std 백본에 서브클로닝하여 쉽게 달성할 수 있습니다. 원래 연구17 에서 사용된 모든 기능화된 항-GFP 나노바디 구조물은 공개 배포를 위해 Addgene과 함께 기탁되었습니다.
위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 여기에 설명된 모든 나노바디 변이체를 높은 수율 및 순도로 정제했습니다(그림 1B). mCherry 융합만이 정제 후 단백질 도메인의 경미한 단백질 분해 클리핑을 나타냈습니다(그림 1B, 레인 5). 관찰된 두 가지 분해 생성물은 겉보기 분자량에서 추론되고 에피토프 특이적 면역블롯 검출에 의해 검증된 바와 같이 개별 VHH 및 mCherry 도메인에 해당할 가능성이 가장 높습니다(그림 1C). 공동 발현된 BirA가 없는 경우, VHH-mCherry는 일반적으로 제제당 약 20mg의 수율로 회수되었습니다. 우리의 경험에 따르면, BirA의 공동 발현은 나노바디 수율을 약 1/3에서 1 /2로 지속적으로 감소시킵니다. BSA와의 1:1 혼합물에서 나노바디가 스트렙타비딘-아가로스에 의해 완전히 회수되었기 때문에 비오티닐화는 상당히 완전했습니다(그림 1D).
엔도사이틱 수송 연구를 위한 이 나노바디 툴킷의 적합성을 평가하기 위해 우리는 뚜렷한 세포내 트래피킹 경로를 가진 EGFP 태그 표면 수용체 단백질을 발현하는 안정적인 HeLa 세포주를 생성했습니다. 여기에는 원형질막과 초기(분류 및 재활용) 엔도좀 사이를 순환하는 TfR이 포함되었습니다. 초기 엔도좀에 의해 원형질막과 TGN 사이를 이동하는 TGN46; TGN, 원형질막, 초기 및 후기 엔도좀 사이를 왕복하는 두 MPR17. EGFP는 각 수용체의 세포외 도메인(특히 CDMPR, CIMPR 및 TGN46에 대한 신호 펩타이드와 수용체 서열 사이에 삽입됨)과 TfR의 C-말단에 융합되었습니다. 이 설계는 천연 세포질 도메인을 보존하여 알려진 모든 분류 신호가 손상되지 않고 세포외 항-GFP 나노바디에 의해 결합하기 위해 EGFP 태그에 접근할 수 있도록 했습니다(그림 1E). 세포외 도메인이 비정상적으로 큰 CIMPR의 경우, 이러한 절단이 정상적인 인체이동 행동을 보존한다는 것을 입증하는 이전 연구와 일치하는 잘린 버전이 사용되었습니다31,32.
안정적인 세포주는 레트로바이러스 형질도입에 의해 확립되었으며, 이어서 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 중간 및 유사한 발현 수준을 가진 균질한 세포 집단을 분리했습니다. 주목할 점은 EGFP-CDMPR이 이질적인 글리코실화를 나타내는 내인성 대응물(33)과 유사하게 면역블롯에서 이중 밴드로 일관되게 나타났다는 것입니다. EGFP 융합 단백질이 내인성 단백질의 정상 상태 국소화 및 발현 패턴을 요약하는지 여부를 평가하기 위해 안정적으로 발현되는 세포를 부모 HeLa 세포와 공동 배양하고 공초점 형광 현미경으로 분석했습니다(그림 2B). EGFP 신호는 해당 내인성 단백질의 분포를 충실하게 반영했습니다. 예상대로 CDMPR, CIMPR 및 EGFP 태그 버전은 말초 엔도좀에 추가 라벨링과 함께 TGN 및 후기 엔도좀 구획을 반영하는 핵주위 영역에 주로 국한되었습니다. 내인성 및 EGFP 태그가 부착된 TGN46은 모두 핵주위 TGN에서 거의 독점적으로 발견된 반면, TfR 및 TfR-EGFP는 두드러진 말초 분류 및 핵주위 재활용 엔도좀과 함께 특징적인 초기 엔도좀 분포를 나타냈습니다. 사용된 항체는 내인성 및 EGFP 태그 형태(CIMPR 제외)를 모두 검출했지만, 융합 단백질을 발현하는 세포에서 전체 염색 강도는 현저하게 증가하지 않았으며, 이는 EGFP 구조가 실질적으로 과발현되지 않았음을 시사합니다. EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP와의 직접적인 비교를 위해 그림 2B에 EGFP-TGN46 및 EGFP-CIMPR을 포함시켰습니다. 세포 고정 및 형광 현미경 이미징에 사용되는 프로토콜은 이전 연구17,19에 설명되어 있습니다.
VHH-mCherry를 사용하여 EGFP 태그 리포터 단백질의 엔도사이틱 수송을 살아있는 세포 이미징으로 모니터링할 수 있습니다. 이를 위해 EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP를 발현하는 세포를 예로 사용하였다. 세포는 배지에 VHH-mCherry를 첨가한 후 도립 광시야 형광 현미경으로 시간이 지남에 따라 이미지화되었습니다(비디오 1 및 비디오 2). 다양한 시점의 정지 이미지가 그림 3에 나와 있습니다. mCherry 채널의 신호를 측정하고, 자가형광 배경을 빼고, EGFP 신호로 정규화하여 표지된 구획의 이동 또는 초점면의 잠재적인 작은 이동으로 인한 변동을 제거함으로써 흡수를 정량화했습니다. 25nM에서 배지에서 VHH-mCherry의 형광은 무시할 수 있었고 측정을 방해하지 않았습니다. 세포 표면에서 세포내 구획으로, 정상 상태 분포로의 리포터의 수송을 분석한 결과, 이전 간행물17의 그림 2에 나타난 생화학적 실험과 동일한 동역학 결과가 나타났으며, 겉보기 흡수 반감기는 EGFP-CDMPR의 경우 ~9분, TfR-EGFP의 경우 ~4분, 포화 후 ~43분 및 ~20분, 각각. 이러한 값은 면역블로팅 분석법을 사용한 생화학적 흡수 실험에서 얻은 값과 비슷했습니다17. 원칙적으로, MPR 농도가 가장 높은 핵주위 영역과 같은 관심 세포내 영역으로의 역행 수송 동역학도 분석할 수 있습니다. 그러나 핵주위 영역에는 골지체/TGN뿐만 아니라 후기 엔도좀과 재활용 엔도좀도 풍부합니다. 핵주위 영역으로의 나노바디 흡수 동역학은 정의된 소기관으로의 역행 수송을 분석하기에 충분히 특이적이지 않습니다. 원형질막에서 TGN으로의 수송을 보다 안정적으로 평가하기 위해서는 형광단 특성의 스펙트럼 중복이 없는 방식으로 또 다른 형광 단백질인 TGN 상주 막관통 단백질이 GFP 리포터 단백질과 함께 안정적으로 공동 발현되어야 합니다. 이 추가 마커를 사용하면 이전에 문서화된 바와 같이 TPST에 의해 매개되는 티로신 황산화와 유사한 리포터 수입 VHH-mCherry를 검출할 수 있습니다19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg"> 
그림 1: EGFP 태그 세포 표면 단백질을 추적하기 위한 유도체화된 나노바디의 설계 및 생산. (A) 유도체화된 나노바디의 개략적 개요. 표준 나노바디 구조물은 GFP 특이적 VHH 도메인, T7 및 HA 에피토프 태그, 비오틴 수용체 펩타이드(BAP) 및 정제를 위한 C-말단 헥사히스티딘(His6) 태그로 구성됩니다. 추가 나노바디 변이체에는 탠덤 티로신 황산화 부위(2xTS), 조작된 과산화효소 APEX2 또는 형광 단백질 mCherry를 사용한 변형이 포함됩니다. 스케일 바는 아미노산(aa) 길이를 나타냅니다. (B) 박테리아 발현 및 친화성 정제된 나노바디(20-50μg)를 그래디언트 SDS-PAGE로 분석하고 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 분자량 표준(kDa)은 왼쪽에 표시되어 있습니다. 경미한 단백질 분해 클리핑은 VHH-mCherry에 대해서만 관찰되었으며, VHH와 mCherry 도메인 사이에서 발생할 가능성이 높습니다. (C) T7, HA 또는 His6 에피토프에 대한 항체를 사용하거나 비오티닐화 평가를 위해 스트렙타비딘-HRP(SA-HRP)에 의해 검출된 항체를 사용하여 나노바디 제제(10ng)의 면역블롯 분석. (D) 나노바디 비오티닐화의 정도는 나노바디를 BSA와 1:1 비율로 배양한 후 스트렙타비딘-아가로스 풀다운, 펠릿화 및 비드의 세척을 통해 평가하였다. 동일한 부피의 상청액(S)과 비드 결합 물질(B)을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 분석했습니다. 비드 결합 분획에서 나노바디의 정량적 회수율은 완전한 비오티닐화를 나타냅니다. 결합된 분획에 VHH 및 mCherry 단편이 모두 존재한다는 것은 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플 준비 중에 발생할 수 있는 부분 분해를 나타냅니다. 차선 2와 3 사이의 흰색 선은 관련 없는 두 차선이 삭제되었음을 나타냅니다. 이 수치는17에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg"> 
그림 2: 형광 표지된 EGFP 태그 화물 수용체의 발현 및 세포내 국소화. (A) EGFP 융합 구조체의 개략적 표현. 분비 막관통 단백질에서 파생된 서열은 검은색으로 표시되며, N-말단 신호 펩타이드와 내부 막관통 도메인은 노란색으로 강조 표시됩니다. EGFP 부분은 녹색으로 표시됩니다. CDMPR, TfR 및 TGN46에 대해 전체 길이 구조가 생성되었으며, 정상적인 인체매매 행동을 보존하기 위해 CIMPR에 잘 특성화된 잘린 변이체가 사용되었습니다. 스케일 바는 아미노산(aa) 길이를 나타냅니다. EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP는 이전에 기술되었습니다17. (B) 세포내 국소화를 평가하기 위해 EGFP 융합 단백질을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 부모 HeLa 세포와 공동 배양하고 형광 현미경으로 분석했습니다. 스케일 바는 10μm를 나타냅니다. (C) EGFP-태그 리포터 단백질을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 용해하고, 단백질 추출물을 SDS-PAGE에 투여한 후 GFP 및 액틴에 대한 항체를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 분자량 마커(kDa)가 오른쪽에 표시됩니다. 이 수치는17에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg"> 
그림 3: EGFP-CDMPR 및 TfR-EGFP에 의해 매개되는 나노바디 엔도사이틱 흡수 동역학의 생세포 이미징. 37°C에서 페놀 적색이 없는 완전 배지에서 (A) EGFP-CDMPR 또는 (B) TfR-EGFP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포에 25nM VHH-mCherry를 첨가한 후 생세포 이미징을 수행했습니다. 세포는 36초 간격으로 반자동 광시야 형광 현미경을 사용하여 GFP 및 mCherry 채널에서 이미지화되었습니다. 대표적인 병합 정지 이미지가 아래 개별 채널에서 핵주위 영역(배율: 2.2x)의 확대 보기와 함께 표시됩니다. (스케일 바, 10μm.) 비디오 1 및 비디오 2도 참조하십시오. (C) EGFP-CDMPR 및 (D) TfR-EGFP에서 나노바디 흡수 동역학의 정량적 분석은 각각 약 40개의 개별 세포를 포착한 3개의 독립적인 실험의 데이터를 사용하여 수행되었습니다. 소기관 움직임과 초점면 변동성을 설명하기 위해 mCherry 형광 강도를 GFP 신호에 대해 정규화(표준)하고 세 실험의 모든 세포에서 평균 ± SD로 표시했습니다. 평균 최대 흡수 신호는 1로 정규화되었습니다. 각 세포에 대한 흡수 동역학은 1차 동역학 모델을 사용하여 개별적으로 적합되었습니다. 표시된 선은 해당 속도 상수의 평균에서 파생된 평균 곡선을 나타냅니다. 이 수치는17에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: EGFP-CDMPR에 의한 mCherry-나노바디 흡수의 생세포 이미징. EGFP-CDMPR을 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 25 nM VHH-mCherry를 포함하는 완전 배지에서 37°C에서 배양하고 EGFP 및 mCherry 형광 채널 모두에서 36초 간격으로 이미지화했습니다. 동영상은 3분/초의 실시간 압축에 해당하는 5프레임/초의 재생 속도로 렌더링되었습니다. 이 영화는17에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2: TfR-EGFP에 의한 mCherry-나노바디 흡수의 생세포 이미징. TfR-EGFP를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포를 25 nM VHH-mCherry가 보충된 완전 배지에서 37°C에서 배양하고 36초 간격으로 EGFP 및 mCherry 형광에 대해 이미지화했습니다. 영화는 5프레임/초로 렌더링되었으며, 이는 3분/초의 타임랩스 속도를 나타냅니다. 이 영화는17에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Endocytosis of receptors and other transmembrane proteins from the cell surface to endosomes and beyond is critical for homeostasis, physiology, and ...

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연구

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Biochemistry

생화학

organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.

기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상

출처: Zhang, Y., et al. 세포내 박테리아에 의한 엔도-리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위한 형광 나노입자의 적용. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 세포내 박테리아에 감염된 인간 상피 세포에서 엔도-리소좀 리모델링을 시각화하기 위해 형광 나노입자를 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 침입 후 병원체는 숙주 세포골격과 엔도-리소좀 시스템을 조작하여 소포 수송을 변경하는 관형 돌출부가 있는 액포를 형성합니다. 그런 다음 형광 표지된 나노입자를 사용하여 이러한 변화를 추적하여 병원체 유발 세포내 트래피킹 사건의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.

세균에 감염된 세포에서 엔도-리소좀 리모델링의 나노입자 매개 시각화

이 비디오는 세포 내 이동 경로를 이해하기 위해 기능화된 나노바디의 흡수 및 역행 수송을 연구하는 방법을 보여줍니다. 방사선 표지된 황산염을 도입하고 분리 및 검출 기술을 활용함으로써 이 방법은 화물 단백질의 내포세포 흡수 및 트랜스 골지 네트워크 도착에 대한 연구를 가능하게 합니다.

기능화된 나노바디를 사용하여 GFP 표지된 표면 단백질이 골지횡단 네트워크에 도착하는 모니터링

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

라이브 셀 이미징은 동적 프로세스를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 고정된 셀의 시험만 정적 사진을, 오해 및 과정에 대 한 혼란으로 이어질 수 있는 제공 합니다. 이 작품 이해, 약물 방출, 및 자주 나노 살아있는 세포에서의 세포내 지역화 하는 방법을 제공 합니다.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

배우세요 기능화된 나노바디를 사용한 HeLa 세포에서의 엔도사이틱 수송 생세포 이미징 방법입니다. 이 기법은 막단백질 역수송 경로를 정량 분석하여 세포 내 물질 이동 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

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