배양 세포에서 기능화된 나노바디를 사용한 엔도사이틱 수송의 생세포 이미징

우리는 막관통 단백질의 엔도사이틱 및 역행성 교통과 수송을 부여하는 메커니즘을 연구하고 있습니다. 세포 표면에서 단백질 이동을 조사하기 위해 일반적으로 기존 항체가 사용되지만, 이는 가교 결합과 리소좀 표적화를 촉진할 수 있습니다. 우선, VHH-mCherry로 변형한 대장균 펠릿을 확보하세요.

박테리아 세포 펠릿에 PBS 내 20밀리몰라 이미다졸이 포함된 얼음 냉각 버퍼 30밀리리터를 첨가합니다. 피펫을 사용해 펠릿을 위아래로 피펫으로 완전히 재현착시킵니다. 재현탁된 혼합물을 라벨이 붙은 50밀리리터 원심분리관으로 옮깁니다.

재현탁된 세포에 200마이크로그램/밀리리터 라이소자임, 20마이크로그램/밀리리터 DNase I, 1밀리몰라 마그네슘 클로라이드, 1밀리몰라 페닐메틸설포닐플루오라이드를 보충합니다. 관을 실온에서 10분간 부양한 후, 끝까지 회전하는 위에 올려놓고 4도 섭씨에서 1시간 동안 계속 배양합니다. 다음으로, 소닉 시스템의 6밀리미터 솔리드 프로브 팁을 셀 현탁액에 직접 삽입합니다.

박테리아 세포를 기계적으로 파괴하여 1분 초음파 펄스 3회로 40% 진폭과 1초 켜짐, 1초 꺼짐의 듀티 사이클을 사용합니다. 각 펄스 사이에 1분간 냉각 간격을 허용합니다. 원심분리 후에는 중력 흐름 작동을 위해 미리 포장된 일회용 태그 정화 컬럼을 사용해 고정 금속 친화성 크로마토그래피를 준비하는 동안 깨끗한 용해물을 얼음 위에 보관합니다.

니켈-니트릴로트리아세트산 컬럼을 금속 받침대나 적절한 컬럼 홀더에 고정하세요. 그 다음 컬럼에서 저장 버퍼를 완전히 배수하세요. PBS에 20밀리몰라 이미다졸이 포함된 결합 완충액 10밀리리터를 추가하여 컬럼을 평형으로 만듭니다.

중력에 의해 완충 장치를 통과시키세요. 정화된 박테리아 용해액 약 30밀리리터를 평형 컬럼에 점차 적용합니다. 중력에 의해 통과하게 두고 흐름은 버리세요.

그 후 PBS에 20밀리몰라 이미다졸이 포함된 결합 완충액 두 번을 연속으로 10밀리리터 용량으로 세척합니다. 결합된 나노바디를 2밀리리터 마이크로 원심분리관에 500밀리몰라 이미다졸 PBS를 들어 있는 2밀리리터의 용출 버퍼를 적용하여 용출합니다. 50밀리리터 튜브 어댑터에 시딩된 탈염 컬럼을 5밀리리터의 PBS로 5번 세척하여 평형을 맞춥니다.

버퍼가 완전히 채워진 수지에 들어가게 한 후, 흐름을 버립니다. 마지막 세척 후에는 컬럼을 1000 x g에서 2분간 원심분리합니다. 이제 플로우 스루를 버린 후 어댑터와 함께 컬럼을 새로운 50밀리리터 집수 튜브로 옮깁니다.

예평형 탈염 컬럼에 용출된 기능성 나노바디 2밀리리터를 적재합니다. 그 후 1000 x g에서 다시 원심분리기로 2분간 루에이트를 수집한 후 VHH-m체리 발현과 순도를 검증합니다. 자동 생세포 영상 시스템 소프트웨어를 실행하세요.

이비디 현미경 챔버를 현미경 단계로 옮기세요. EGFP와 mCherry를 위한 여기 및 방출 필터를 이용한 두 개의 영상 채널을 설정했습니다. 사진 표백을 피하려면 짧은 노출 시간과 낮은 조명 강도를 선택하세요.

모든 실험에서 설정을 일정하게 유지하세요. 기자마다 설정이 다를 수 있습니다. 각 조건에 대해 3개에서 4개의 초점이 맞춰진 10개의 서로 다른 시야의 좌표를 점 목록에 저장합니다.

그 후 VHH-mCherry를 추가하기 전에 점 목록의 각 위치를 한 장씩 캡처하여 참조 이미지로 활용합니다. 엔도사이토시스를 시작하려면 단층 교란을 최소화하면서 각 웰에 미리 데워진 VHH-mCherry 용액 350마이크로리터를 부드럽게 첨가합니다. 그 다음에 이미지 획득을 진행하세요.

32초 간격으로 100프레임 동안 타임랩스 획득을 수행하며, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 유지합니다. VHH-mCherry의 엔도사이틱 흡수를 분석하려면 타임랩스 이미지 세트를 이미지 분석 소프트웨어에 로드합니다. 분할 및 추적 도구를 적용하여 관심 영역 간 시간에 따른 내화된 형광을 정량화합니다.

모든 기능화된 나노바디 변종은 고수율과 고순도로 정제되었으며, VHH-mCherry만이 경미한 단백질분해 분해를 보였다. VHH-mCherry의 분해 산물은 에피토프 특이적 면역블롯 검출을 통해 개별 VHH-mCherry 도메인으로 확인되었습니다. BirA가 없는 상황에서는 VHH-mCherry가 각각 약 20밀리그램으로 회수되었습니다.

그리고 나노바디 BSA 혼합물의 스트렙타비딘 아가로스 풀다운으로 비오티닐화가 확인되었습니다. HeLa 세포에서 발현된 EGFP 표지 융합 단백질은 EGFP-CDMPR 및 EGFP-CIMPR의 핵주위 위치 등 내인성 유사 단백질과 일치하는 세포 내 위치 패턴을 보였습니다. EGFP-TGN46의 핵 주위 독점 및 TfR-EGFP의 말초 위치 확인.

VHH-mCherry는 EGFP-CDMPR의 엔도사이틱 수송을 생세포 시각화하여 60분 동안 증가하는 공동위치화를 보였습니다. VHH-mCherry가 EGFP-CDMPR 발현 세포로 흡수되는 과정은 약 43분 후에 정체기에 도달했으며, 반감기는 9분이었습니다. TfR-EGFP 발현 세포에서는 VHH-mCherry가 세포 간 축적이 빠르게 이루어져 반감기가 4분이고 20분 후 포화되었습니다.

우리는 세포 표면에서 모든 막관통 단백질의 수송을 분석할 수 있는 다목적 나노바디 기반 툴킷을 구축했습니다. 우리는 형광 나노바디를 이용해 표면 화물 단백질을 표지하고, 그 다음에 생세포 현미경을 통해 이들의 엔도사이믹 수송을 연구합니다. 나노바디 기반 생세포 영상 접근법을 통해 지표면에서 골지체 네트워크 화물 운송을 이끄는 경로를 밝혀내고자 합니다.