K562 세포의 후성유전학적 공학: dCas9-DNMT3A 및 -HDAC1 융합 단백질을 사용한 안정적인 표적 DNA 메틸화를 위한 이중 벡터 에피솜 전략

저희 연구는 K562 세포에서 지속 가능한 후생유전학적 편집을 탐구하는 표적 DNA 메틸화를 위한 안정적이고 비통합적인 시스템을 개발하는 것을 목표로 합니다. 최근 이 분야의 발전으로는 후생유전적 효소를 결합하여 시너지적이고 안정적이며 국소 특이적인 후생유전학적 변형을 구현하는 이중 효과자 CRISPR-dCas9 시스템이 있습니다. 우선, T75 배양 플라스크에 K562 세포를 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 및 가습 조건에서 유지하세요.

260나노미터 분광광도계를 사용해 형질전환에 사용할 에피소말 DNA를 정량합니다. 각 트랜스펙션마다 총 플라스미드 DNA 8마이크로그램을 사용하며, 각 플라스미드당 4마이크로그램을 조제하여 공동 트랜스펙션을 진행하고, 필요한 양을 90마이크로리터의 초순수수와 혼합합니다. 이제 희석된 DNA 용액에 3몰라르 아세테이트 나트륨 용액 100마이크로리터와 100% 에탄올 2.5부피를 추가하세요.

DNA 용액을 충분히 섞어 20도 섭씨에서 하룻밤 배양하여 DNA 침전을 허용합니다. 다음 날, DNA 침전관을 11,000G에서 4도에서 15분간 원심분리합니다. 생물안전 캐비닛 내 멸균 조건에서 튜브에서 상청액을 조심스럽게 버리세요.

튜브에 70% 에탄올 500마이크로리터를 넣어 펠릿을 세척한 후, 11,000G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다. 다음으로, 튜브에서 에탄올 상원액을 완전히 제거하고 DNA 펠릿을 공기 중에 건조시켜 눈에 띄는 에탄올이 남지 않을 때까지 기다립니다. 그 후 건조된 DNA 펠릿을 50마이크로리터의 DMEM에 완전히 재현탁합니다.

재현탁된 DNA 400나노그램을 약 2.5마이크로리터 양의 새 튜브에 보관하고, 플라스미드 DMEM 용액은 4도 섭씨 온도에서 보관하여 추가 사용 전까지 보관합니다. 남은 DNA 샘플을 1%아가로스 겔에 대신해 DNA 정제와 무결성을 검증합니다. 배양 합류율이 50%에서 60%에 도달하면 T75 플라스크에서 K562 세포를 채취하여 최적의 형질전환 효율을 보장합니다.

적혈구계를 사용해 채취한 세포를 세고, FBS나 항생제 없이 900 마이크로리터의 DMEM이 담긴 35밀리미터 배양 접시에 2×10의 10제곱 세포를 담은 부피를 옮깁니다. 배양 접시를 37도 이산화탄소와 함께 37도 인큐베이터에 넣어 세포를 형질전환 준비 상태로 유지하세요. 제조사 지침에 따라 플라스미드를 전달하기 위해 리포펙타민 기반 형질전환 키트를 사용하고, 필요 시 양을 조절하세요.

미리 준비된 플라스미드 DMEM 용액에 3마이크로리터의 P3000 시약을 첨가합니다. 부드럽게 섞고, 실온에서 5분간 배양하세요. 이제 5마이크로리터의 리포펙타민 3000 시약과 충분한 DMEM을 추가하여 최종 100마이크로리터 부피를 만듭니다.

이 형질전환 혼합물을 상온에서 15분간 배양하세요. 35밀리미터 배양 접시에 100마이크로리터의 형질전환 혼합물을 추가합니다. 접시를 부드럽게 흔들어 혼합물이 고르게 퍼지게 한 후 인큐베이터에 다시 넣으세요.

형질전환 후 24시간 후, 각 접시에 10% FBS와 1배 페니실린 스트렙토마이신을 보충한 전액 배지 DMEM 3밀리리터를 추가하여 형질전환 세포의 증식을 촉진합니다. 형질전환 72시간 후, G418 항생제를 추가하여 최종 농도인 1밀리리터당 1밀리그램에 도달하여 선별을 시작하세요. 선택 과정이 확립되고 총 세포 수가 1 곱하기 10의 6제곱을 넘으면, 300G에서 25도 섭씨에서 6분간 원심분리하여 세포를 채취합니다.

펠릿을 한 번 무균 PBS로 세척한 후, pH 약 7.4로 한 번 세척한 후 같은 조건에서 다시 원심분리기를 합니다. 최종 세포 펠릿을 1회 PBS에 재현탁한 후, 헤모세포미터를 사용해 세포 농도를 측정합니다. 현탁액을 1 곱하기 10의 6 세포 1밀리리터로 희석하여 세포가 완전히 재현탁되도록 하고, 세포를 유세포검사 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 96웰 조직 배양 처리판을 수집 장치로 사용하여 형광 활성화 세포 분류기를 단일 세포 모드로 설정합니다. 사용하는 악기에 따라 소프트웨어 설정을 조정하세요. 전방 산란과 측면 산란을 기준으로 세포를 선택하여 1차 집단을 게이트로 하여 예상 크기와 과립도를 분리합니다.

잔해와 매우 과분화되거나 죽은 셀을 제외하고, 전방 산란 면적과 높이 또는 측면 산란 면적과 높이 플롯을 사용해 싱글렛을 게이트하세요. 그 후 96웰 플레이트의 각 웰에 1밀리그램당 1밀리그램의 G418이 포함된 100마이크로리터의 풀 매질을 미리 채우고, 37도 인큐베이터에서 플레이트를 가열합니다. 정확도를 높이기 위해 단일 셀 모드에서 정렬 속도를 초당 300 이벤트 이하로 유지하세요.

분류 후 현미경으로 각 웰을 검사하여 각 웰에 단일 세포가 있는지 확인하고, 플레이트를 5% 이산화탄소가 포함된 37도 인큐베이터에 넣습니다. 단일 세포 클론들이 96웰 플레이트에서 개별적으로 확장되도록 허용합니다. 클론 성장이 뚜렷해지면, 환원된 G418이 포함된 배지를 최종 농도인 400 마이크로그램/밀리리터로 첨가하여 선택 압력을 유지합니다.

잘 성장한 클론을 순차적으로 12웰 플레이트로, 그 다음 T25 플라스크로, 마지막으로 T75 플라스크로 옮겨 각 클론이 약 1x10의 6 셀의 거듭제곱에 도달할 때까지 진행합니다. 다음으로, 일정한 간격으로 이중 세포 펠릿을 수집하세요. 유전체 DNA 추출을 위해 펠릿 한 개를 영하 20도에 보관하세요.

두 번째 펠릿을 TRIzol 시약 500마이크로리터에 균질화하고, RNA 추출과 보완 DNA 합성을 위해 섭씨 영하 20도 상태로 보관합니다. 페놀-클로로포름 추출 후 에탄올 침전을 통해 선택된 클론에서 유전체 DNA를 추출합니다. 추출한 DNA를 뉴클레아제가 없는 물 또는 TE 완충제에 완전히 재현탁합니다.

다음 단계로 진행하기 전에 분광광도계를 사용해 DNA 농도와 순도를 측정하세요. 마지막으로, TRIzol 시약을 사용해 저장된 세포 펠릿에서 총 RNA를 추출한 후 이소프로판올 침전을 진행합니다. 단일 세포는 형광 활성화 세포 분류를 통해 96웰 플레이트에 분류되어 두 구조를 모두 가진 개체를 분리했습니다.

확장된 10개의 클론에 대한 PCR 분석 결과, 230염기쌍과 205염기쌍의 밴드로 나타나는 일부 구조체만이 두 구조체를 모두 유지함이 확인되었습니다. 파이로시퀀싱 결과, 양성 클론 2는 gRNA1 표적 영역 근처 여러 CPG 부위에서 메틸화가 증가한 것으로 나타났으며, 이는 형질전환되지 않은 대조군에 비해 나타났다. 우리는 비통합된 장기 전달 시스템의 부족을 해결하여, 숙주 게놈을 변경하지 않고도 정밀하고 안정적인 후생유전학적 편집을 가능하게 합니다.

우리의 연구 결과는 표적 메틸화를 통한 유전자 조절을 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 확립하고, 정밀한 후생유전학적 치료 개발을 뒷받침합니다. 향후 연구에서는 에피소말 전달 개선, 표적 효과 최소화, Cas9 효율성 향상, 그리고 시스템을 1차 또는 생체 내 모델에 맞게 적응시키는 방안을 탐구할 것입니다.