포유류 세포에서 정량적 영상을 이용한 세포내 니코틴 아세틸콜린 수용체의 원형 및 세포내 원형질막 위치

니코틴성 아세틸콜린 수용체가 포유류 원형질막으로의 수송을 이해하는 것은 샤페론 매개 조절 연구와 표적 선택적 치료제 평가에 매우 중요합니다. pH 민감 프로브와 생체 세포 공초점 현미경을 결합하는 주요 장점은 소단위 위치의 높은 공간 해상도입니다. 우선, 시약을 섭씨 37도까지 예열하세요.

nAChR 소단위체 DNase를 완전히 해동하고 형질전환 시약을 상온으로 옮깁니다. 모든 시약을 생물안전 캐비닛에 넣기 전에 70% 에탄올로 세척하세요. 알파-7 nAChR을 발현하기 위해 마이크로 원심분리관 내에서 알파-7과 NACHO 플라스미드 DNase를 환원 혈청 배지에 희석합니다.

DNA 첨가 후 피펫으로 부드럽게 섞으세요. 또는 알파-4 베타-2 수용체를 발현시키기 위해 각 소단위체 DNA 4마이크로그램을 희석하여 총 250마이크로리터의 환원 혈청 배지로 섞어 부드럽게 혼합합니다. 특정 수용체 아이소폼의 발현을 최적화하기 위해 소단위체 비율을 조정하세요.

추가적인 플라스미드가 있는 알파-4 베타-2 수용체의 경우, 각 플라스미드 DNA를 같은 양으로 첨가합니다. 다음으로, 새로운 마이크로 원심분리관에서 8마이크로리터의 형질전환 시약을 250마이크로리터의 환원 혈청 배지에 드롭 형태로 희석합니다. 실온에서 5분간 배양한 후, 희석된 DNase와 희석된 형질전환 시약을 한 방위로 튜브에 섞습니다.

피펫으로 부드럽게 섞은 후 실온에서 20분간 배양하세요. 복합체가 형성되는 동안, 배양 배지의 배지를 1밀리리터의 혈청 무첨가 EMEM으로 교체하세요. 각 접시에 DNA 형질전환 시약 복합체 500마이크로리터를 드롭 양쪽으로 추가하세요.

특히 유리 바닥 표면에 접시를 흔들어 고르게 섞으세요. 플레이트를 37도 섭씨에서 24시간 배양한 후 4-6시간 후에 배지를 교체합니다. 흡입으로 기존 매체를 제거하세요.

상온에서 PBS 2밀리리터로 각각 10분씩 세 번 세척하세요. 그 다음 접시에 pH 7.4 이미징 버퍼 2밀리리터를 추가하세요. 공초점 현미경의 슬라이드 홀더에 영상 접시를 삽입하고, 홀더를 미리 가열된 환경 챔버에 넣습니다.

연동 펌프 튜브를 영상 접시 홀더에 연결하고 환경 챔버를 닫으세요. 이제 영상 소프트웨어를 실행하고 관심 있는 형광체에 대한 레이저를 선택하세요. 접시를 스캔하여 10-60배 대물렌즈를 사용해 이미징을 위해 세포를 찾아보세요.

원한다면 확대를 높이고, 필요에 따라 초점 깊이를 조절하세요. 선호하는 해상도를 선택하고 원하는 대시선으로 단일 이미지를 촬영하세요. 버퍼 변경 후 같은 셀을 재배치하기 위해 접시 지도에 위치를 기록하세요.

접시의 여러 부분에 대해 동일한 촬영 설정으로 반복 촬영하세요. 유출 라인만 연동 펌프에 연결한 채, pH 7.4 완충제를 접시에서 폐기통으로 천천히 빨아들여 넣으세요. 그 다음 입구 라인을 pH 5.5 담냉 버퍼로 옮깁니다.

연동 펌프를 켜서 pH 5.5 완충제를 분당 1.5밀리리터의 유량으로 추가하여 셀이 계속 부착되도록 하세요. 20분 후에는 펌프를 끄고 세포를 완충 내에서 추가로 20분간 배양하여 평형을 맞춥니다. 인큐베이션 후에는 저장된 위치를 반복적으로 촬영합니다.

이미지 정량화를 시작하려면 ImageJ를 열고 분석할 이미지를 불러오세요. 이미지는 각 캡처된 채널이 같은 프레임에 스택된 형태로 나타납니다. 위상 채널로 이동하세요.

이미지가 너무 밝게 보이면 프로세스 메뉴에서 대비 향상을 선택한 후 확인을 클릭하세요. 확대경 도구를 사용해 한 셀을 확대하세요. 프리핸드 선택 도구를 사용해 위상 채널의 셀 윤곽을 따라 그려보세요. 그 다음 관심 있는 형광체에 해당하는 형광 채널로 전환합니다.

분석(Analyze)을 선택하고 측정값 세트(Set Measurements)를 클릭하여 원하는 측정값을 설정하세요. 면적, 평균 회색값, 통합 밀도를 반드시 확인하세요. 선택한 영역을 측정하려면 분석(Analysis)을 선택한 후 측정(Measure)을 클릭하세요.

선택한 셀 근처의 빈 영역을 따라 세 가지 배경 측정을 합니다. 원하는 모든 셀에 대해 측정을 수행한 후, 측정 데이터를 복사하여 엑셀에 붙여넣어 분석합니다. 그 다음 세 가지 배경 측정값에서 평균 배경 평균을 계산합니다.

제공된 공식을 사용하여 각 세포별로 보정된 총 세포 형광 또는 CTCF 값을 계산합니다. 같은 워크플로우를 사용해 버퍼 변경 후 획득한 이미지를 분석하세요. 모든 결과를 통계 처리를 위해 데이터 분석 소프트웨어로 내보내세요.

비형질전환 N2a 세포에서는 약한 알파-BTX AF647 염색이 관찰되었고, 알파-7 DNA로 형질전환된 세포에서는 견고한 점상 표지가 관찰되었습니다. 정량화 결과, 알파-7 nAChR의 원질막 발현이 알파-7 형질전환된 N2a 세포에서 비형질감염 대조군보다 유의하게 높았음이 확인되었습니다. pH 7.4에서는 원형질막에서 총 알파-7 pHuji 형광이 관찰되었다.

형질전환된 N2a 세포에서 발견되었습니다. pH 5.5에서는 알파-7 pHuji 형광이 감소하여 내부 수용체 위치가 드러났습니다. 외부 알파-7 pHuji 수용체 형광이 수용체 발현의 대부분을 차지했다.

정량화 결과 알파-7 pHuji 수용체의 82.6%가 원형질막에 위치해 있으며, 17.4%는 내부에 위치해 있음이 나타났다. pH 7.4로 돌아오자 형광이 복원되어 pHuji 신호 가역성이 확인되었습니다. pH 7.4에서 알파-4 SEP와 베타-2 pHuji를 발현하는 N2a 세포는 두 소단위체 모두에서 강한 막 형광을 보였다.

pH 5.5에서는 형광이 소광되어 일부 알파-4 SEP와 베타-2 pHuji 소단위체가 내부 위치함을 나타냈다. 정량화 결과 알파-4 SEP의 76.5%가 원질막에 위치해 있었고, 23.4%가 내부에 있는 것으로 나타났습니다. 삼중 형질전환 세포에서 알파-4 SEP는 82.8%의 막 위치와 17.2%의 내부 발현을 보였습니다.

같은 세포에서 베타-2 pHuji 소단위의 63.4%는 막에 국소 있고, 36.6%는 세포 내에 위치했습니다. 제시된 프로토콜을 사용하여 니코틴 수용체 발현 및 거래에 대한 새로운 샤페론 효과를 특성화하고, 새로운 표적 선택적 치료제를 평가하였습니다. 우리 프로토콜의 장점 중 하나는 동질성 및 이형형 니코틴 수용체에 대한 적응성으로, 상대적인 세포 위치를 정량화할 수 있다는 점입니다.

저희 접근법은 빠르고 강력한 니코틴 수용체 원형질막 발현을 가능하게 하여 샤페론 매개 밀매 분석과 신약 개발 노력을 지원합니다.