숙주-병원체 상호작용 연구를 위한 마우스 전립선 오가노이드 기반 모델 생성

이 연구는 박테리아 병원체가 전립선 상피를 어떻게 감염시키는지, 그리고 어떤 숙주 병원체 상호작용이 감염 결과를 결정하는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 기존의 시험관 내 모델은 전립선 상피의 다양성을 제대로 포착하지 못했습니다. 이 모델은 조직 내에 존재하는 다양한 세포 유형을 반영하는 생리학적으로 적합한 시스템을 제공합니다.

우선, 24웰 플레이트에서 세포외기질 방울 위에 3차원 마우스 전립선 오가노이드를 배양합니다. 원하는 수의 웰에서 배지를 흡입한 후 각 웰에 500마이크로리터의 신선한 배양지를 추가하세요. P 1000 피펫을 사용하면 각 웰에서 세포외 기질 떨어짐을 기계적으로 방해합니다.

이 현탁은 15밀리리터 원뿔형 튜브에 수집하며, 튜브당 최대 두 개의 웰을 채취합니다. 신선한 배양지를 넣어 부피를 10밀리리터로 만듭니다. 튜브를 부드럽게 세 번에서 네 번 뒤집어 혼합 후 450G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리합니다.

상정액을 흡인하세요. 펠릿을 효소 용액 2밀리리터에 다시 담근 후 37도까지 예열한 후 37도 수조에서 15분간 배양합니다. P 1000 피펫을 사용해 인큐베이션 동안 세포 현탁액을 5분마다 혼합합니다.

배양 후에는 신선한 배양지를 추가하여 최종 부피 10밀리리터에 도달합니다. 튜브를 부드럽게 세 번에서 네 번 뒤집어 섞으세요. 450G에서 4도 섭씨에서 5분간 원심분리기.

펠릿을 흐트러뜨리지 않고 상정액을 흡인하세요. 300마이크로리터의 배양지에 10마이크로몰라 암석 억제제를 보충하여 펠릿을 재현탁합니다. 노이바우어 계수실을 사용해 현탁액 내 셀을 세어보세요.

현탁액을 10마이크로몰라 암 억제제를 보조한 배양지에서 62,500 세포/밀리리터 농도로 희석합니다. 그 다음 48웰 플레이트에 대해 웰당 200마이크로리터의 현탁액을, 챔버드 마이크로 슬라이드에 대해 300마이크로리터를 시딩합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양하세요.

하루 후에는 대부분의 단일 세포가 2차원 배양 표면에 부착되었는지 확인하세요. 배양지를 2일에서 3일마다 교체하고, 7일 이내에 수합할 때까지 배양을 계속하세요. 분화를 유도하여 하강 세포를 풍부하게 하기 위해, 씨앗 시 세포 현탁액에 5-알파 디하이드로테스토스테론 또는 DHT 10나몰을 첨가합니다.

요로병원성 대장균(UPEC)을 LB 한천 플레이트에 100마이크로그램/밀리리터 암피실린을 첨가하여 스트레이팅합니다. 플레이트를 37도 섭씨에서 16시간에서 24시간 동안 배큐하세요. 멸균 루프 접종을 사용하여 LB 육수 3밀리리터에 100마이크로그램/밀리리터의 암피실린을 보충하여 단일 박테리아 집락을 사용합니다.

배양물을 37도 섭씨에서 정적으로 12시간에서 16시간 동안 배양합니다. 밤새 박테리아 배양을 보폭시켜. 배양물의 광학 밀도를 600나노미터에서 측정하세요.

그 다음, 3밀리리터의 육수에서 시작 광학 밀도 0.05를 달성하기 위해 필요한 배양 부피를 계산합니다. 계산된 박테리아 배양 양을 신선한 암피실린 보조 LB 육수에 추가하세요. 37도에서 24시간 정적으로 배양하세요.

배양 후에는 박테리아 배양물을 소용돌이로 처리하세요. 광학 밀도를 600나노미터에서 측정하세요. 광학 밀도 1을 달성하기 위해 필요한 배양 부피를 계산합니다.

필요한 부피를 12,000G에서 실온에서 2분간 원심분리합니다. 흡인하고 상정액을 버리세요. 박테리아 펠릿을 1밀리리터의 프리머스와 DHT 없는 자유 오가노이드 배양 배지에 재현탁합니다.

그 후 마우스 전립선 유기질 배양액으로 현탁액을 희석하여 감염 배수가 100에 달합니다. 준비된 오가노이드 기반 모델에서 배양지를 흡입하세요. 48웰 플레이트의 각 웰에 박테리아가 포함된 배양 배지 200마이크로리터를 추가합니다.

5% 이산화탄소와 함께 37도 섭씨의 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 배양하세요. 웰에서 배지를 포함한 박테리아를 흡입하고, 신선한 배양액으로 웰을 세 번 세척하여 세포외 박테리아를 제거합니다. 다음으로, 50마이크로그램/밀리리터 겐타마이신이 들어 있는 배양지를 추가하고 30분간 배양합니다.

매체를 흡입하세요. 남은 감염 기간 동안 10마이크로그램/밀리리터 겐타마이신을 보충한 신선한 배양지를 추가하세요. 공초점 현미경을 사용해 형광 염색 후 감염된 세포를 영상화하고, 유세포계를 사용해 감염된 세포를 정량합니다.

디하이드로테스토스테론이 없는 대조군에서는 대부분의 세포가 사이토케라틴을 보였으며, 5개의 기저세포가 양성이었으며, 소수만이 낮은 CD 24 8 루미날 발현을 보였다. 1나노몰 DHT를 보조하면 혼합된 기저 하강 집단이 생성되었으나, CD 24 A는 낮은 수준을 유지했습니다. DHT를 10나노몰로 증가시키면 배양 7일 후에도 일부 기저 세포가 유지되는 동안 하내막 세포로의 분화가 촉진되었습니다.

이는 시간이 지남에 따라 5개의 양성 기저세포 사이토케라틴 감소와 CD 24A 양성 하강세포 증가, DHT 농도가 증가한다는 정량화 연구와 상관관계가 있었습니다. 감염 후 0시간에는 UPEC가 상피 세포에 높은 수로 부착되었습니다. 겐타마이신 치료를 1시간 후 UPEC 양성 세포 수가 급격히 감소했습니다.

24시간 동안 감염된 세포 수는 1시간 때와 비슷했습니다. 24시간 동안 공초점 영상 촬영에서 세포 내 박테리아가 계속 복제되어 군집 유사 군집을 형성하는 것이 확인되었습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 상피 세포 다양성을 보존하는 모델에서 박테리아 감염 역학과 병원체 상호작용을 연구할 수 있게 합니다.

향후 연구에서는 이 모델을 활용해 감염, 암 생물학 등 다양한 전립선 질환을 조사하고 잠재적 치료 화합물을 시험할 수 있습니다.