마우스 배아 줄기 세포에서 유전자 간/유전자 내 인핸서 RNA 정량화를 위한 계산 파이프라인

우리 연구팀은 강화제 후생유전학과 후생전사체학을 연구하며, 강화제 RNA를 강화제 활성화 지표로서 정량화하는 정확한 방법 개발에 집중하고 있습니다. 유전자 내 증강제가 숙주 전사체와 함께 존재하기 때문에, 증강체 DER 신호를 구별하고 정량화하는 것은 도전적입니다. 시작하려면 터미널을 열고 인핸서 식별에 필요한 파일과 참조를 준비하는 명령을 입력하세요.

터미널에서 작업 디렉터리에 들어가는 명령어를 입력하세요. 그 다음 인핸서 식별 스크립트를 현재 디렉터리에 복사하는 명령을 실행하세요. 그 다음 해당 명령을 실행하여 gen code 주석을 사용해 프로모터 영역, 유전자체 및 단백질 코딩 유전자에 대한 BED 파일을 생성합니다.

증강제 식별을 위해 ATAC-seq 및 히스톤 ChIP-seq 파일을 준비합니다. 터미널에서 적절한 전처리 명령을 입력하세요. 다음으로, 크로마틴 피크 데이터를 사용해 증강제를 정의하고 분류하는 명령을 실행하세요.

임시 가닥 정보를 인터제닉 인핸서 BED 파일에 할당하는 명령을 입력하세요. 다음으로, 두 가닥에 위치한 유전자와 겹치는 간유전자 강화체의 올바른 가닥 방향을 결정하는 명령을 입력하세요. 그 후 같은 가닥에서 인핸서가 겹치는 유전자에 대해 가닥 특이적 RPKM을 계산하세요.

그 다음 인터제닉 인핸서에 대한 가닥 할당을 최종 확정하는 명령을 입력하세요. 최종 가닥 정보를 모든 간기생성 강화체와 그에 대응하는 정상 영역에 할당합니다. 터미널에서 파이프라인 루트 디렉터리로 이동하는 명령을 입력하세요.

그 후 적절한 명령을 사용하여 후속 분석 준비를 위한 스크립트를 복사합니다. 적절한 명령을 사용해 증강제 집계, GRO-seq 신호 처리 및 증강제 RNA 정량화에 필요한 모든 파일을 준비하세요. 다음으로, 작업 디렉터리에 입력하기 위해 스크립트를 입력한 후 후속 분석에 필요한 스크립트를 복사합니다. 각 강화제 정상 주변의 염색질 신호 패턴을 보여주는 집계 플롯을 만드는 것.

터미널에 해당 명령을 입력하세요. 프롬프트가 반환되면 GRO-seq에서 기능 수를 이용해 증강제 RNA 발현 수준을 정량화하는 명령을 입력하세요. 마지막으로 스크립트를 실행하여 GRO-seq 데이터셋을 사용해 강화제 그룹 간 강화제 RNA 발현 수준을 시각화하고 비교 R.In.

트리밍 전부터 폴리뉴클레오타이드 꼬리가 존재했으며, 트리밍 매개변수를 적용한 후 성공적으로 제거되었으며, 최종 ATAC-seq 데이터셋은 트리밍 전에 두 빨간색 쌍 모두에서 검출되었고, H3K27 아세틸화 전처리를 통해 어댑터 오염이 최소화되어 기본 트리밍만 필요로 하는 것으로 확인된 후 제거되었습니다. ATAC-seq 데이터 필터링 결과 71,165개의 비운동 개방 염색질 영역이 발견되었으며, 이 중 47,317개의 강화체 영역이 포함되어 있었고, 이 중 23,147개는 히스톤 표지와의 중복을 바탕으로 활성 강화자로, 24,170개는 비활성 강화서로 분류되었으며, 모든 강화체 영역 중 45.2%는 간기체, 54.8%는 인트제닉이었습니다. 이 분포는 비활성 및 활성 강화제 범주 모두에서 유사하게 나타났다.

NENO 유전자 상류의 유전자 간 증강제는 ATAC-seq, H3K4 모노 메틸화, H3K27 아세틸화 및 GRO-seq 신호에 대해 강한 농축을 보였다. CHD2 유전자 근처의 인트-유전자 강화체는 NENOG 인핸서와 유사한 염색질과 전사 특성을 보였으며, 네 가지 데이터 세트 모두에서 명확한 신호를 보였습니다. 집계 플롯 결과, 활성 증강제들이 ATAC-seq, H3K4 모노메틸, H3K27 아세틸화 신호의 농축을 함께 조절하는 것으로 나타났습니다.

비활성 증강제는 H3K27 아세틸화 농축이 없었으나, 강한 ATAC-seq 및 H3K4 모노메틸 신호를 유지했습니다. 활성 증강제는 유전자 간 및 유전자 내 영역 모두에서 비활성 증강제보다 유의미하게 높은 GRO-seq 유도 전사율을 보였습니다. 우리는 유전자 간 또는 유전자 내 맥락에서 활성 의존적 전사로 검증된 추세 인식 eRNA 계산 파이프라인을 구성합니다.

우리는 특히 숙주 게놈에 의해 혼란된 유전자 내 증강제에 대해 표준화된 접근 가능한 eRNA 정량의 DER을 다룹니다. 우리는 자체 주도 식별, 추세와 벤치마크 분석 파이프라인 모두에서 운영 전사본을 개정하고, 유전체 조립체, 실험 프로토콜, 세포 유형에 걸친 벤치마크 분석 파이프라인을 개선할 것입니다.