클로닝을 위한 핵 기증자로서 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 분리하는 간단한 미세 흡기 기법
2025년 12월 19일
이 프로토콜은 냉동 보존된 말 정액에서 생존 가능한 체세포(SCs)를 분리하는 간단한 미세 흡인 기법을 제시합니다. 전통적인 방법과 달리, 이 기술은 장기간 시험관 배양을 피하고 정자 오염을 극복하여 체세포 클로닝에 즉각적으로 활용할 수 있게 합니다.
우리는 냉동 보존된 말 정액에서 체세포가 유전적 가치가 높은 개체를 회수하는 데 유용할 수 있음을 보여주고자 합니다. 현재 우리의 과제는 핵 기증자로 사용할 온전한 이배체 DNA를 가진 체세포를 선정하는 것입니다. 먼저, 액체 질소 탱크에서 말 정액 빨대를 제거하세요.
10초간 공기에 노출시킨 후, 37도 섭씨의 물에 30초간 녹여 보관하세요. 해동된 정액 250마이크로리터 샘플을 채취하세요. 보충된 DMEM-F12 배지로 1밀리리터를 희석하세요.
정액 혼합물을 37도 섭씨에서 30분간 배양하세요. 배양된 희석액에서 25마이크로리터를 튜브에 피펫팅하여 추출하고, DPBS 975마이크로리터에 0.1밀리그램/밀리리터의 폴리비닐 알코올 또는 폴리비닐 피롤리돈을 첨가해 희석합니다. 서스펜션을 부드럽게 섞어주세요.
희석된 정액 혼합물을 세포 채취 과정 내내 37도로 유지하세요. 희석된 말 정액이 담긴 페트리 접시 뚜껑을 현미경 스테이지에 올려 체세포 채취를 준비합니다. 체세포 채취에 적합한 직경의 마이크로피펫을 선택하여 기계적 흡인 시스템에 연결하세요.
마이크로피펫을 조심스럽게 마이크로 드롭에 삽입하고 접시 뚜껑 바닥과 정렬하세요. 피펫이 배양지를 흡인한 후에는 체세포의 개별 포획을 시작하세요. 마이크로 드롭의 바닥에 집중하세요. 그곳에는 다양한 세포 형태가 보입니다.
마이크로피펫 팁을 각 체세포 옆에 위치시키고, 음압으로 흡입하세요. 크기에 상관없이 둥근 세포와 길쭉한 세포를 모두 수집하세요. 10개의 세포를 모은 후, 접시 뚜껑 상단에 위치한 10마이크로리터 마이크로 방울에 넣습니다.
수집 과정 내내 이 미세 방울 내에 모든 체세포를 유지하세요. 원하는 수의 체세포를 채취하면, 미세 방울을 이용한 간단한 세척 절차를 수행하여 정자, 이물질, 미생물 오염물질을 제거합니다. 두 번째 접시 뚜껑을 사용해 체세포를 순차적으로 3단계 세척합니다.
마이크로피펫을 사용해 체세포를 첫 번째 방울에 옮기고, 3분에서 5분간 가라앉게 하세요. 첫 번째 방울에서 두 번째 방울로 같은 방법으로 세포를 옮깁니다. 한 번 더 옮기고 체세포를 세 번째 방울에 넣습니다.
마지막으로, 분리된 체세포를 체세포 핵 이식용으로 지정된 준비된 마이크로 드롭에 침착시킵니다. 마이크로 흡인 기법은 냉동 보존된 말 정액에서 체세포를 성공적으로 회수했으며, 세 마리의 종마에서 시간당 317.7에서 424.7 세포 포획 속도로 이루어졌습니다. 3번 종마가 가장 높은 수확량을 보여준다.
크기와 형태를 바탕으로 다섯 가지 뚜렷한 체세포 유형이 확인되었습니다. 우리는 냉동 보존된 말 정액에서 형태와 생존 능력이 다른 체세포 집단을 확인했으며, 이는 핵 기증자로 유용할 수 있습니다. 세포는 형태학에 따라 선택할 수 있으며, 이 절차는 1차 배양을 확립할 필요가 없습니다.
우리는 말 정액을 부피한 후 이 세포들의 생존 가능성을 향상시키는 데 집중할 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 동결 보존된 말의 정액으로부터 생존 가능한 체세포를 분리하는 마이크로 흡인 기술을 제시합니다. 이 방법은 장시간의 체외 배양과 정자 오염을 피하고, 체세포 복제에 즉시 사용할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 생식 생물학
배경
- 동결 보존된 말의 정액으로부터 체세포를 유래할 수 있습니다.
- 생존 가능한 체세포의 분리는 복제 목적에 매우 중요합니다.
- 전통적인 방법은 종종 긴 배양 시간을 포함합니다.
- 정자의 오염은 복제 과정을 방해할 수 있습니다.
연구 목적
- 말의 정액으로부터 체세포를 분리하는 기술을 시연합니다.
- 고유전자 가치를 지닌 개체를 복제하기 위해 이러한 세포의 사용을 가능하게 합니다.
- 선택된 체세포가 손상되지 않은 이배체 DNA를 가지도록 합니다.
사용된 방법
- 액체 질소에서 말의 정액 스트로를 해동합니다.
- 37도의 수욕에서 해동합니다.
- 보충된 DMEM-F12 배지로 해동된 정액을 샘플링하고 희석합니다.
- 세포 분리를 위해 마이크로 흡인 기술을 적용합니다.
주요 결과
- 생존 가능한 체세포의 성공적인 분리.
- 과정에서 정자 오염의 감소.
- 분리된 세포의 즉각적인 복제 가능성.
- 선택된 세포의 이배체 DNA 무결성 보존.
결론
- 마이크로 흡인 기술은 체세포 분리에 효과적입니다.
- 이 방법은 말의 체세포 복제 가능성을 향상시킵니다.
- 미래 응용은 말 번식에서 유전자 회복을 개선할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Efficient recovery of viable somatic cells from cryopreserved equine semen addresses a critical bottleneck in genetic resource utilization for advanced reproductive technologies. This microaspiration technique enables immediate access to diploid donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT), bypassing the need for prolonged culture and mitigating sperm contamination. The approach expands the potential for genetic rescue and portfolio diversification in animal biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of somatic cell viability and diploid status from cryopreserved samples.
- Supports functional validation of nuclear donor suitability for SCNT workflows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing morphological selection of donor cells.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, reproducible method for isolating somatic cells free from sperm interference.
- Delivers standardized cell populations for downstream cloning assays without primary culture establishment.
- Enables quantitative assessment of cell yield and morphology for process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from genetic resource banking to preclinical cloning applications.
- Aligns with translational objectives by enabling recovery of high-value genotypes from archived material.
- Reduces biological risk by ensuring donor cell integrity prior to embryo generation.
Pipeline & Workflow Integration
This microaspiration method integrates at the interface of genetic resource recovery and SCNT-based cloning, bridging cryopreservation banking with immediate nuclear donor preparation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on donor cell viability and genetic integrity from cryopreserved sources.
- Screening: Standardizes somatic cell isolation for reproducible SCNT input.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell yield and morphological diversity.
- Translational Research: Connects biobanked semen to actionable cloning workflows for genetic rescue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for diverse genetic backgrounds and archived samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in donor cell suitability and reduces mechanistic ambiguity in SCNT.
- Operational Value: Streamlines cell isolation, enhances reproducibility, and eliminates lengthy culture steps.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions for genetic recovery projects and optimizes resource allocation.
- Portfolio Impact: Expands the range of viable genetic material for cloning and risk-adjusted breeding strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation and cell morphology assessment.
- Needs access to mechanical aspiration systems and microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for cell selection and washing procedures.
- Adaptable to various semen samples but may require optimization for different species or preservation conditions.
- Cell viability post-isolation may vary and should be monitored for SCNT readiness.
