퍼옥시좀 특이적 프로브를 이용한 포유류 세포 내 과산화체 염색

그래서 우리의 연구는 지질 대사와 세포 산화 균형에 필수적인 소기관인 페르옥시좀을 이해하는 데 집중합니다. 우리는 이들의 구조와 기능이 어떻게 조절되는지, 그리고 이러한 과정들이 질병에서 어떻게 변화하는지 밝히는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 우리는 형광 탐침을 개발하여 우리와 더 넓은 과학계가 다양한 동물 세포에서 페옥시좀을 시각화할 수 있게 합니다.

여기서 우리는 생세포와 고정 세포 모두에서 효과적인 염색 프로토콜을 개발하여 건강 및 병리학에서 파록세틴 생물학을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다. 주요 실험적 과제 중 하나는 동물 세포에서 페옥시좀을 비침습적으로 표지하는 것입니다. 항체 염색이 이를 극복하는 데 도움이 되지만, 발작성 단백질에 대한 상업적으로 구할 수 있는 항체가 부족합니다.

또 다른 도전 과제는 실시간으로 비침습적으로 퍼옥시좀을 시각화하는 것으로, 적응 가능한 프로토콜이 필요합니다. 마지막으로, 일반적인 염색은 기능적인 측정값을 제공하지 않습니다. 과산화효소 기반 염색은 발작 기능에 따라 달라질 수 있는데, 이는 도전이자 기회이기도 합니다. 왜냐하면 세포 내 발작 기능 상태를 구별할 수 있기 때문입니다.

전날 포유류 세포를 덮개 슬립이 30%에서 70% 정도 합류율의 플레이트에 시종을 심어 시작하세요. 과산화좀 프로브를 빛에 민감한 미세 원심 튜브에서 신선한 배지로 희석하여 최종 농도는 4마이크로몰을 만듭니다. 원하는 우물을 선택하고 마커펜으로 외부에 표시하세요.

선택한 우물에서 0.5밀리리터의 매체를 흡입하고, 준비된 프로브 매체로 우물 벽을 따라 한 방울씩 교체합니다. 분제 후에는 세포를 37도 섭씨에서 10분에서 15분간 배양하세요. 이제부터는 알루미늄 호일로 셀을 빛으로부터 차단하세요.

인큐베이션 후에는 착색된 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그 후 플레이트를 화학 보호막 아래에 넣고, PBS에 4%의 파라포름알데히드를 세포에 첨가한 뒤 실온에서 20분간 배양합니다. 고정 후에는 파라포름알데히드를 지정된 폐기물에 옮기고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.

다음으로 PBS에 0.5%의 Triton X를 첨가하여 세포를 투과시키고 2.5분간 배양합니다. 배양 후에는 트리톤 X를 제거하고 각 세포를 PBS로 각각 10분씩 두 번 세척합니다. 세포를 차단하기 위해 5% 소 혈청 알부민을 PBS에서 4도 섭씨 온도에서 하룻밤 배양하세요.

표준 프로토콜에 따라 면역형광 염색 절차를 수행하세요. 마지막으로, 현미경으로 고정 세포와 살아있는 세포 모두의 이미지를 획득합니다. Peroxi_SPY 프로브로 생세포 염색을 한 결과, ATP 결합 카세트 하위 계통이 과산화좀에 D에 의존하여 대사 활성 세포에서 높은 과산화체와 세포질 형광 비율을 발생시켰습니다.

GFP-SKL을 발현하는 야생형 HEK-293T 세포에서는 Peroxi_SPY555 염색이 페옥시좀과 뚜렷한 공존 위치가 나타났으나, PEX19 녹아웃 세포에서는 페옥시좀이 없는 경우 염색이 없었다. 인간 섬유아세포에서는 Peroxi_SPY 염색이 발작 마커인 GFP-SKL과 함께 위치하여 과산화좀 표적화를 확인했습니다. 과산화체의 밀도 정량 검사는 다양한 세포 유형 간에 유의미한 차이가 있음을 보여주었습니다.

COS-7 세포에서 250나노몰 Peroxi_SPY를 20분간 최적화한 염색 조건은 원래 10분간 1마이크로몰라 프로토콜에 비해 과옥시좀과 세포질 형광 비율을 유의미하게 증가시켰습니다. HEK-293T 세포를 24시간 동안 Peroxi_SPY과 함께 장기간 배양하면, 과산화좀 염색이 감소했음에도 불구하고 15분에 비해 세포질과 형광 강도 비율이 개선되었습니다. 고정 프로토콜을 통해 HuH-7과 HEK-293T 세포에서 보존된 Peroxi_SPY 표지와 항-PEX14 면역염색을 통해 성공적인 항체 코스테인이 입증되었습니다.

정량화 결과, 고정 및 투과화 절차가 생세포 염색과 비교했을 때 과산화체-형광 강도에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌습니다. 우리는 살아있는 동물 세포와 고정된 동물 세포 모두에서 과옥시좀을 시각화할 수 있는 Peroxi_SPY 염료를 개발했습니다. 저희 형광 탐침은 이전에는 제한적이었던 과산화체 역학, 이질성, 기능 장애를 간단하고 신속하게 연구할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 프로토콜은 발작성 질환을 가진 환자 유래 세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 영상 기반 과산화체체 연구를 가능하게 할 것입니다.