디지털 액상 PCR(ddPCR)을 이용한 토양 내 미생물 바이오매스 측정

우리 연구는 방울 디지털 PCR과 전체 유전체 시퀀싱을 사용하여 다양한 토양 유형의 미생물 생체량을 정량화합니다. 기존 방법은 대규모 토양 샘플과 유해 화학물질이 필요합니다. ddPCR은 절대 유전자 및 바이오매스 탄소 정량을 위해 최소한의 토양을 사용합니다.

먼저, 토양 DNA 추출 키트의 시약을 조립하여 20도 실온에서 토양 미생물로부터 DNA를 분리합니다. 2밀리리터 비드 두드리는 튜브를 잠시 돌려 비즈가 바닥에 가라앉았는지 확인하세요. 흙 100밀리그램을 넣고, 용액 CD1 800마이크로리터를 넣고 잠시 와류를 넣어 혼합하세요.

비드 밀 균질기를 초당 6미터 속도로 40초간 사용해 샘플을 완전히 용해한 후, 실온에서 15,000g의 비드 박동관을 1분간 원심분리하여 기계적 세포 용해를 달성합니다. 토양 입자가 남아 있을 수 있는 상원액을 깨끗한 2밀리리터 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 용액 CD2 200마이크로리터를 추가하세요.

5초간 소용돌이, 1분 동안 15,000g에서 원심분리기. 최대 700마이크로리터의 상원액을 청정한 2밀리리터 마이크로 원심분리관에 펠릿을 손상시키지 않고 옮기세요. 상정액에 600마이크로리터의 용액 CD3를 추가하고 5초간 소용돌이로 넣습니다.

혼합물 650마이크로리터를 15,000g 원심분리기에 1분 동안 넣습니다. 플로우 스루를 버리고 남은 용해액에 대해 같은 과정을 반복하세요. 다음으로, 스핀 컬럼을 깨끗한 2밀리리터 수집관에 넣습니다.

500마이크로리터의 용액 EA를 스핀 컬럼에 넣고 15,000g 원심분리기를 실온에서 1분간 사용합니다. 플로우 스루를 버리고 스핀 컬럼을 같은 수집관에 다시 넣습니다. 앞서 보여준 대로 500마이크로리터의 C5 용액을 스핀 컬럼과 원심분리기에 추가합니다.

흐름 흡수물을 버린 후, 스핀 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집관에 넣고 16,000g 원심분리기를 실온에서 2분간 보관합니다. 스핀 컬럼을 새로운 1.5밀리리터 용출관에 넣으세요. 스핀 컬럼의 여과막 중앙에 용액 C6를 50에서 100마이크로리터 정도 추가합니다.

15,000g에서 1분 동안 원심분리기. 스핀 컬럼을 버린 후 용출액이 담긴 튜브를 4도 섭씨에서 보관하세요. 제조업체 지침에 따라 형광도계와 이중 가닥 DNA 광범위 분석 키트를 사용하여 추출된 DNA를 정량화합니다.

박테리아와 곰팡이 분석의 경우, 특정 16S rRNA와 18S rRNA 프라이머를 선택하세요. 해동 후에는 모든 시약을 얼음 위에 소용돌이로 옮기세요. 디지털 비말 중합효소 연쇄 반응(ddPCR)을 설정하세요.

드롭렛 제너레이터 카트리지, 즉 DG8을 카트리지 홀더에 넣습니다. 카트리지 내 각 샘플 웰에 총 20마이크로리터의 반응 혼합물을 첨가합니다. 그 다음 Evagreen용 Droplet Generation Oil 70마이크로리터를 잘 표시된 오일 카트리지에 넣으세요.

카트리지를 드롭 제너레이터에 넣고 가스켓으로 덮으세요. 생성된 방울 40마이크로리터를 96웰 반스커트 플레이트의 각 웰에 전달하여 PCR 증폭을 진행합니다. 플레이트 실러를 180도 섭씨로 미리 설정한 상태로 5초간 밀봉하세요.

열 사이클링 프로필을 설정하고 가열된 뚜껑을 105도로 설정하세요. PCR이 완료된 후에는 96웰 플레이트를 플레이트 리더로 옮깁니다. QuantaSoft 버전 2.1을 사용해 진폭의 임계값을 조정하여 음수와 양수액을 분리합니다.

각 우물에서 DNA의 나노그램당 유전자 복제본 수, 추출된 DNA 나노그램당 총 유전자 복제본, 추출 과정에서 처리된 토양의 건조 중량당 유전자 복제본, 토양 건조 중량당 세포 수 등 매개변수를 평가합니다. 또한, 우물당 토양 건조 중량당 박테리아와 곰팡이 함량에 해당하는 미생물 바이오매스 탄소(MBC)를 계산하세요. 5개 장소의 토양 DNA를 3회 분석한 결과, 평균적인 미생물 DNA 농도는 건조 토양 1그램당 32나노그램에서 4,590나노그램에 이르는 것으로 나타났습니다.

토양 B는 16S rRNA 유전자 복사본이 가장 적어 평균 8.8 곱하기 10의 7의 제곱 제곱, 18S rRNA 유전자 복사본은 건조 토양 1g당 평균 4.6 곱하기 10의 제곱 곱 제곱으로 가장 적었다. 반면, 토양 E는 건조한 토양 1g당 각각 4.4 곱하기 10 곱, 2.5 곱하기 10 곱하기 9의 제곱으로 16S 및 18S rRNA 유전자 복제 수가 가장 많았으며, 이는 다른 모든 샘플과 크게 차이가 났다. 토양 A, B, C, D 전반에서 균류 복제본은 유사했으나, 토양 D의 박테리아 수는 B와 E 양쪽에서 유의미하게 달랐습니다. 토양 E에서 가장 높은 미생물 함량이 관찰되었고, 토양 B에서 채취된 샘플에서는 가장 낮은 미생물 함량이 A, D, E와 유저히 달랐습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 미생물 생체량과 균류 대 박테리아 비율을 통해 토양 군집 역학과 구조를 측정할 수 있게 합니다.

드롭렛 디지털 PCR에 사용되는 동일한 템플릿 DNA를 DNA 시퀀싱에 사용하여 미생물 군집 및 기능 분석을 가능하게 할 수 있습니다.