Name: 자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-22T12:25:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 기계학습 기반 자동 세포 분할을 활용한 1차 인간 기도 상피 세포에서의 단일세포 수준 칼슘 신호 측정 방법입니다. 이 기술은 형광 현미경 영상과 머신러닝 소프트웨어를 결합하여 고속 무편향 분석을 가능하게 합니다.

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<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Jairaman, A., Prakriya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+airway+epithelial+cells%3A+Current+understanding+and+implications+for+inflammatory+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).</li>
<li>Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+storage+in+health+and+disease%3A+a+dynamic+equilibrium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium.</a> Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).</li>
<li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), e1796(2008).</li>
<li>Ren, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+protects+RPE+cells+from+necroptosis+and+NLRP3+activation+via+promoting+SERCA2-related+intracellular+Ca2%2B+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis.</a> Phytomedicine. 135, 156088(2024).</li>
<li>Dwivedi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TMEM16A+blockers+benzbromarone+and+MONNA+cause+intracellular+Ca2%2B+release+in+mouse+bronchial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells.</a> Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, e1067(2009).</li>
<li>Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+%5BCa2%2B%5Di+in+whole+cell+suspensions+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2.</a> Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-disruptive+technique+for+loading+calcium+buffers+and+indicators+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells.</a> Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).</li>
<li>Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+secretion+and+sequestration+in+macrophages.+A+blocker+of+organic+anion+transport+reveals+that+these+processes+occur+via+a+membrane+transport+system+for+organic+anions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions.</a> J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).</li>
<li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ca2%2B+indicator+for+long-term+tracking+of+intracellular+calcium+flux%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux.</a> BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).</li>
<li>Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+immunological+barriers+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Physiological and immunological barriers in the lung.</a> Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).</li>
<li>Quach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+fetal+lung+atlas+reveals+the+temporal+dynamics+of+epithelial+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity.</a> Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).</li>
<li>Deprez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+human+healthy+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the human healthy airways.</a> Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).</li>
<li>Prescott, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+in+vitro+air-liquid+interface+culture+models+of+the+human+airway+epithelium+evaluating+cellular+heterogeneity+and+gene+expression+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution.</a> Respir Res. 24 (1), 213(2023).</li>
<li>Gunawardena, T. N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophysiological+and+fluorescence-based+measurements+of+modulator+efficacy+in+nasal+epithelial+cultures+derived+from+people+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis.</a> Cells. 12 (8), 1174(2023).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rescue+of+c.3846G%3EA+%28W1282X%29+in+patient-derived+nasal+cultures+achieved+by+inhibition+of+nonsense-mediated+decay+and+protein+modulators+with+complementary+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cyst+Fibros%22%5BJournal%5D)">Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action.</a> J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).</li>
<li>Terrance, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+nasal+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary human nasal epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).</li>
<li>Perniss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+succinate%2FSUCNR1-brush+cell+defense+program+in+the+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium.</a> Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).</li>
<li>Sehgal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+sarco%2Fendoplasmic+reticulum+%28ER%29+Ca2%2B-ATPase+by+thapsigargin+analogs+induces+cell+death+via+ER+Ca2%2B+depletion+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response.</a> J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).</li>
<li>Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/cal-520-am">https://www.aatbio.com/products/cal-520-am</a> (2025).</li>
<li>Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552">https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552</a> (2025).</li>
<li>Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+the+world+upside-down+in+cellulose+for+improved+culturing+and+imaging+of+respiratory+challenges+within+a+human+3D+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model.</a> Cells. 8 (10), 1292(2019).</li>
<li>Becker, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+airway+epithelium+reveals+that+mucociliary+clearance+modulates+SARS-CoV-2+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread.</a> Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트 & nbsp;</td><td>Thermofisher와 nbsp;</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24웰 트랜스웰 인서트와 nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>96웰 평평한 투명 바닥 검은색 폴리스티렌 TC 처리 마이크로플레이트</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520 AM</td><td>AAT 바이오퀘스트&nbsp;</td><td>21130</td><td>-20&deg 위치에 분리 및 저장; C, DMSO에 녹아</td></tr><tr><td>칼슘 스위트 소프트웨어</td><td>코드는 저희 연구실에 연락하여 요청할 수 있습니다</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMEM, 1x.</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>320-005-CL</td><td>저장 온도는 4도; 참고;</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 &nbsp;</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>080-450</td><td>-20&deg 위치에 분리 및 저장; C</td></tr><tr><td>플루오-4 AM&nbsp;</td><td>AAT 바이오퀘스트&nbsp;</td><td>20550</td><td>-20&deg 위치에 분리 및 저장; C, DMSO에 녹아</td></tr><tr><td>젠장</td><td>바이오샵</td><td>HEP001.5</td><td>상온에서 보관</td></tr><tr><td>Hoechst&nbsp;</td><td>Thermofisher와 nbsp;</td><td>H3570</td><td>저장 온도는 4도; 참고;</td></tr><tr><td>인간 상피 대장항생암 세포 계통 &nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB-55</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>7786-30-3</td><td>상온에서 보관</td></tr><tr><td>마이크로 디쉬 35mm, 낮은 유리 바닥</td><td>이비디&nbsp;</td><td>80137</td><td>상온에 보관 중이며;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>450-200-EL</td><td>저장 온도는 4도; C</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Wisent&nbsp;</td><td>3111-010-CL</td><td>상온에 보관 중이며;</td></tr><tr><td>염화칼륨 &nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>7447-40-7</td><td>상온에 보관 중이며;</td></tr><tr><td>프로베네시드&nbsp;</td><td>서모피셔</td><td>P36400</td><td>-20&deg 위치에 분리 및 저장; C, 수용성 &nbsp;</td></tr><tr><td>염화나트륨 &nbsp;</td><td>바이오샵과 nbsp;</td><td>SOD004</td><td>상온에 보관 중이며;</td></tr><tr><td>탑시가르긴과 nbsp;</td><td>서모피셔</td><td>T7458</td><td>-20&deg 위치에 분리 및 저장; C 용해된 DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>TripLE 익스프레스 효소(1X), 페놀 레드 & nbsp;</td><td>서모피셔</td><td>12605010</td><td>저장 온도는 4도; C</td></tr></tbody></table>

자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상

Fluorescence-Based Calcium Imaging in Primary Human Airway Epithelial Cultures Using Automated Cell Segmentation

Calcium signaling is critical in a multitude of biological processes, reinforcing the need to develop methods to study calcium flux in primary tissue. The ...

fluorescence-based-calcium-imaging-primary-human-airway-epithelial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

여기에서는 2차원 타임랩스 이미지 시퀀스 내에서 양의 신호 영역에 할당된 최적의 타원 정렬을 기반으로 하는 새로운 관심 영역 분석 프로토콜이 시연됩니다. 이 알고리즘을 통해 연구자는 최소한의 사용자 입력 및 바이어스로 생리학적 Ca2+ 신호를 종합적으로 분석할 수 있습니다.

동적 칼슘의 자동 분석<sup&gt; 2 +</sup이미지 시퀀스에서&gt; 신호

여기에서는 Ca2+ 지표가 로드된 온전한 포유류 세포에서 형광 현미경을 사용하여 로컬 IP3 매개 Ca2+ 이벤트를 이미징하는 기술과 이러한 이벤트의 식별 및 분석을 자동화하는 알고리즘을 제시합니다.

이미징 로컬 CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; 배양 된 포유 동물 세포에서 신호

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

우리는 플레이트 리더를 사용 하 여 박막 조건 하에서 기도 표면 액체 pH의 동적 측정을 할 수 있는 프로토콜을 제시 한다.

1 차 인간 기도 상피 세포의 기도 표면 액체 pH의 실시간 반 자동화 형광 측정

우리는 형광 칼슘 화상 진찰을 계면 혼성화에서 결합하는 2개의 부분 프로토콜을 제시합니다, 실험자가 단하나 세포 수준에 유전자 발현 단면도와 칼슘 활동의 패턴을 상호 연관시키는 것을 허용하.

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

이 프로토콜은 비강 상피 세포 수집, 확장 및 기관형 기도 상피 세포 모델로의 분화와 라이브 셀 이미징 및 맞춤형 스크립트를 통한 섬모 박동 빈도의 정량화를 설명합니다.

섬모 박동 빈도의 정량화를 위한 1차 인간 비강 상피 세포 모델의 수집, 확장 및 분화

이 프로토콜은 래트 기관지로부터 내인성 상피의 선택적 제거 및 루멘 표면 상의 외인성 세포의 균질한 분포를 허용하는 이미징-활성화된 생물반응기를 기술하고, 이어서 세포-조직 구축물의 장기 시험관내 배양을 허용한다.

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심혈관 질환은 전 세계적으로 주요 사망 원인입니다. 혈관 석회화는 심혈관 이환율 및 사망률의 부담에 실질적으로 기여합니다. 이 프로토콜은 형광 영상화에 의해 시험관내에서 혈관 평활근 세포 매개 칼슘 침전을 정량화하는 간단한 방법을 설명합니다.

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우리는 비브라톰과 아가로스 포매된 폐 조직을 활용하여 폐 절편을 생성하는 조직 처리 기술을 개발하여 폐 구조의 고해상도 이미지를 획득할 수 있습니다. 특정 폐 구조 마커를 사용하여 공간 단백질 발현을 관찰하기 위해 면역형광 염색을 사용했습니다.

다중 형광 이미징을 위한 Agarose-Embedded 폐 조직의 자동 진동 절편

여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

배우세요 기계학습 기반 자동 세포 분할을 활용한 1차 인간 기도 상피 세포에서의 단일세포 수준 칼슘 신호 측정 방법입니다. 이 기술은 형광 현미경 영상과 머신러닝 소프트웨어를 결합하여 고속 무편향 분석을 가능하게 합니다.

자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상

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