자동 세포 분할을 이용한 1차 인간 기도 상피 배양에서의 형광 기반 칼슘 영상

단세포 전사체학은 낭포성 섬유증 기도 상피의 이질성을 밝혀냅니다. 우리는 세포 유형에 따른 특이적 기능과 변화가 질병 발병 기전에 어떤 영향을 미치는지 이해하고자 합니다. 현재의 과제는 단일 세포 단백질체학과 기능을 정확히 측정하는 것입니다.

이 역시 기술 개발이 필요합니다. 우선, Eagle's 최소 필수 배양 배양 배양 배지에 20% FBS와 1%페니실린 스트렙토마이신을 보충한 T-25 플라스크에 Calu-3 세포를 유지하세요. 세포가 약 70% 합류에 도달하면 PBS 5밀리리터로 세포를 세척합니다.

세척 후에는 세포에 1밀리리터의 트라이플레(TrypLE)를 직접 첨가하고, 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 설정한 인큐베이터에 10분에서 15분간 보관합니다. 그 후 4밀리리터의 신선한 완전 배양 배지를 첨가하여 TrypLE를 중화시키고 세포 현탁액을 완전히 혼합합니다. 셀을 약 90%에서 100% 합류 지점에서 96웰 플레이트에 도금하며, 이는 웰당 약 40,000개의 셀에 해당합니다.

세포가 96웰 플레이트에 밤새 달라붙도록 하세요. 배지를 매일 교체하고, 수합 후 2일에서 5일간 세포를 계속 배양하여 분화를 진행합니다. 실험 당일에는 Calu-3 세포를 세척하고 적절한 염료로 배양하세요.

다음으로, 2.5밀리몰라 프로브네시드를 칼슘 버퍼에 희석한 100마이크로리터를 웰당 첨가하여 염료를 세포질 공간 내에 유지하고, 영상 촬영 전까지 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 감싸 둡니다. 1차 기도 세포를 위해서요. 트랜스웰에서 기저측 매체를 제거하고 300마이크로리터의 칼슘 완충제를 추가하여 꼭대기 쪽을 세척합니다.

그 다음 750마이크로리터의 칼슘 버퍼를 추가하여 기저외측 쪽을 세척합니다. 피펫으로 버퍼를 제거하고 양쪽 면을 한 번 더 반복하세요. 다음으로, 세포를 세포 꼭지 쪽에 200마이크로리터, 기저외측 쪽에 600마이크로리터 염료액을 37도 섭씨, 5% 이산화탄소 환경에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 중에는 칼슘 완충제에 희석한 타프시가르긴을 중간 3배 육즙으로 준비합니다. 최종 2마이크로몰 농도를 얻기 위해 농도를 6마이크로몰로 조절합니다. 배양 후에는 피펫팅으로 양측 끝과 기저측 구획에서 염료 용액을 제거합니다.

세포를 두 번 세척하여 첨단 쪽에는 300마이크로리터의 칼슘 완충제를, 기저외측 쪽에는 750마이크로리터의 칼슘 완충제를 사용해 세척합니다. 그 다음 피펫팅으로 버퍼를 제거하세요. 다음으로, 2.5밀리몰라 프로브네시드 칼슘 완충제에 100마이크로리터를 넣고, 기저측 구획에도 같은 용액 500마이크로리터를 추가합니다.

트랜스웰 인서트를 플레이트 안에 넣고, 전체 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호한 뒤, 감싼 플레이트는 영상 촬영을 위해 따로 두세요. 피지 신청서를 열어보세요. 파일을 선택하고 열기를 선택해 동영상 파일을 업로드하세요.

결과로 나오는 팝업 창에서는 모든 기본 설정을 유지하고 선택을 확인하세요. 원한다면 Image를 선택하고 Adjust를 선택한 후 Brightness Contrast를 클릭하여 이미지 표시를 조정하세요. 개별 형광 채널의 밝기와 명암비를 조절하여 세포를 최적의 관측을 얻으세요.

셀 추적을 쉽게 하려면 이미지를 선택하고 색상을 선택한 후 채널 병합을 하세요. 팝업 창에서 각 채널에 적절한 파일을 할당하고 선택을 확인하세요. 추적을 위해 분석, 도구 선택을 선택한 후 ROI 관리자를 엽니다.

결과적인 팝업 창에서 모두 보기와 라벨 옵션을 모두 활성화하세요. 자유손 선택 도구를 사용해 세포 경계와 핵 염색을 바탕으로 개별 세포를 꼼꼼히 따라 그립니다. 그 다음 T 키를 눌러 추적된 각 셀을 ROI 목록에 추가하세요.

시야의 네 모서리와 영상 중앙에 셀이 모두 추적되도록 하세요. 모든 셀을 정확히 추적한 후, ROI 관리자 창에서 더보기를 클릭하고 다중 측정을 선택하세요. 결과적인 팝업 창에서 확인 버튼을 눌러 측정을 시작하세요.

피지에서 비디오 파일을 열어보세요. 영상 조정 도구를 사용해 핵 및 녹색 형광 채널을 최적화하세요. 채널이 최적화되면, 이미지를 선택하고 복제를 선택하여 단일 프레임을 복제합니다.

결과로 나오는 팝업 창에서 중복 스택을 선택 해제하고 중복된 이미지를 PNG 이미지 파일로 저장하세요. 다른 채널의 프레임 복제를 이미지(Image)를 선택하고 복제(Duplicate)를 선택해 반복하세요. 팝업 창에서 확인 버튼을 누르면 이미지가 PNG 파일로 저장됩니다.

두 저장된 이미지를 합치려면 Image를 선택하고 Color를 선택한 후 Merge Channels를 클릭하세요. 그 다음 각 PNG 파일을 적절한 채널에 할당하고 병합을 확인하세요. 병합된 이미지를 셀 포스트 그래픽 사용자 인터페이스에 업로드하여 셀 마스크를 생성합니다.

Cyto3 모델을 선택하여 핵 염색을 채널 1로, 세포질 염색을 채널 2로 분할합니다. 이제 생성된 마스크 이미지를 PNG 파일로 저장하세요. 피지에서 열어 TIFF 파일로 변환하세요.

마지막으로 마스크 파일 및 원본 비디오 파일을 칼슘 스위트에서 드래그 앤 드롭하여 소프트웨어 인터페이스에 열어보세요. 분석 데이터를 클릭하면 모든 분석된 셀에 대해 정규화 및 원시 강도 값이 담긴 다운로드 가능한 그래프와 CSV 파일을 생성할 수 있습니다. Thapsigargin 자극 후 개별 Calu-3 세포에서 Fluo-4 AM과 Cal-520 AM을 모두 사용해 측정했을 때, thapsigargin 후 최대 칼슘 의존적 형광 활성화는 Cal-520 AM으로 측정된 Calu-3 세포에서 Fluo-4 AM보다 유의하게 높았다. 마찬가지로, 타프시가르진 자극 후 개별 일차 기도 및 기관지 세포는 시간이 지남에 따라 정상화된 형광이 증가하였습니다.

또한, 칼슘 의존성 형광 활성화가 최대 수준에서 Cal-520 AM을 적재한 세포에서 유의하게 더 높았습니다. 머신러닝 기반 분석을 통해 단일 시야에서 1,441개의 개별 세포에서 칼슘 의존적 형광 변화를 확인하고 정량화하였습니다. 소프트웨어가 생성한 정규화된 형광 흔적은 Thapsigargin 자극 후 1,441개의 확인된 세포 모두에서 칼슘 반응을 보였습니다. 우리의 연구는 서로 다른 세포 유형이 환경에 반응하는 방식을 이해하는 데 도움을 주며, 이는 표적 치료제 개발에 도움이 될 것입니다.

우리의 발견은 서로 다른 세포 유형에 초점을 맞추고, 특정 생세포가 환경 자극에 반응하도록 도출할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 앞으로는 질병과 건강한 세포에서 세포 유형 특이적 신호전달이 어떻게 변화하는지, 어떤 유형이 원인인지 규명할 계획입니다.