생체 내 생 체 내 자궁경부 림프관 수축성과 생쥐 림프관 수축성 및 림프 흐름 영상을 재현 가능한 장비

우리는 마우스에서 경추 림프관 수축력과 적혈구 림프관 제거에 대한 새로운 영상 촬영의 필요성을 제시합니다. 경추 림프관의 기능을 연구하는 것은 특히 림프류 수축성과 추적자 순환의 수축성을 장기간 관찰해야 할 때 도전적입니다. 우선, 길이 270mm, 너비 43mm의 강철 광학 레일을 장치의 베이스로 놓으세요.

강철 광학 레일 위에 두 개의 기둥 홀더를 설치하여 두 기둥 간 간격을 175밀리미터로 유지하세요. 직경 12밀리미터의 마운팅 포스트 두 개를 포스트 홀더에 삽입하고 각각 M6 나사로 고정하세요. 그 다음 두 개의 장착 기둥 각각에 포스트 칼라를 부착하세요.

장착 기둥 중 하나에 직각의 고정 기둥 클램프를 고정하고 M6 나사로 단단히 고정하세요. 직각 포스트 클램프의 측면 구멍에 12밀리미터 장착 포스트를 삽입하세요. 삽입된 측면 장착 포스트에 3D 프린팅 홀더를 부착하고 두 쌍의 M3 나사로 단단히 고정하세요.

UV 경화 접착제를 사용해 12mm 직경의 커버 유리를 보호용 3D 프린팅 케이스 하단에 부착합니다. 그 다음 M4 나사/너트 쌍으로 3D 프린팅된 홀더에 보호 케이스를 고정하세요. 두 개의 테이블 클립과 M6 나사, 너트, 와셔 세트를 사용해 강철 광학 레일 베이스에 수직 이동을 위한 정밀 팬터그래프 테이블을 설치하세요.

그 다음 길이 155밀리미터, 너비 110밀리미터의 3D 프린팅 케이스를 테이블 위에 올려놓습니다. 이 케이스는 식염수 용액을 축적하는 저장소 역할을 합니다. 선과 가열 요소 1의 연결 지점을 얇은 실리콘 층으로 덮으세요.

온도 센서 1을 매트에 고정하고 실리콘으로 밀봉하세요. 가열 요소와 온도 센서의 전선을 다선 케이블에 납땜하세요. 연결 부위를 실리콘으로 채우고 수축 랩으로 닫으세요.

가열 요소 2와 온도 센서 2를 폼 롤러에 넣으세요. 전원 케이블 커넥터와 전원 버튼을 컨트롤 유닛 케이스 벽에 고정하세요. 인클로저 내부에 24볼트 직류 전원 공급 장치, 직류 스텝다운 컨버터, 그리고 두 개의 MOSFET 모듈을 설치하세요.

회로를 조립하고 필요한 부품을 납땜한 후, Arduino Uno와 키보드 화면을 뚜껑 하우징에 고정하세요. 온도 선택 필드를 찾아보세요. 온도를 조절하고 프레스 런을 하세요.

마취 후에는 수술 중 눈알이 건조해지지 않도록 양쪽 눈꺼풀에 연고를 바르세요. 뒷다리 철수 반사와 꼬리 접기 반사가 멈추면, 쥐를 등을 대고 가열 요소 위에 눕혀 복부 접근을 가능하게 합니다. 제어 장치를 175에서 240볼트 교류 입력 전압의 콘센트에 연결하세요.

의료용 테이프를 사용해 동물의 몸을 테이블 표면과 평행하게 고정하고, 머리를 시상축에 대해 각도를 이루어 목의 한쪽이 롤러에 닿도록 합니다. 윗 앞니에 결찰을 감아 장치 뒤쪽에 부착하고, 의료용 테이프를 사용해 동물의 체온을 유지하세요. 다음으로, 목 부위의 털을 면도하세요.

남은 털을 제거하고 멸균 구역을 보호하기 위해 동물을 덮어주세요. 1차 소독은 알코올 면봉으로 목 피부를 소독하세요. 그 후 0.5% 클로르헥시딘 용액 또는 2% 요오드 용액을 살려 소독 과정을 두 번 더 반복합니다.

발가락 집는 반사로 마취 깊이를 확인한 후, 아래턱에서 쇄골까지 목 피부를 따라 약 2센티미터 길이의 종방향 절개를 하여 피부절개술을 시행합니다. 그 후 미세수술용 곡선 가위를 이용한 근막 절제술을 시행합니다. 굽은 핀셋을 사용해 침샘과 표면 목 근육을 부드럽게 밀어 흉쇄유돌근을 드러내세요.

눈에 보이는 혈관이 손상되지 않도록 하고, 조직 손상을 방지하기 위해 수술 부위를 식염수로 지속적으로 적셔야 합니다. 미세수술용 가위를 사용해 흉쇄유돌근의 근절개술을 시행하여 기관과 경동맥 사이 부위에 접근할 수 있게 합니다. 근육과 근막을 계속 확장하며 근절개술과 근막절개술을 모두 시행하세요.

다음으로, 5밀리미터에서 7밀리미터 깊이에 심부 경추 림프절과 구심성 림프관을 찾아 보세요. 고정된 동물을 고정한 장치를 이동식 현미경 테이블 위에 올려놓으세요. 그리고 영상 촬영 중 안정성을 보장하기 위해 M6 나사로 단단히 고정하세요.

식염수 용액이 미리 채워진 카테터를 의료용 테이프로 마운팅 포스트에 부착하세요. 동물 머리 옆에 가열 요소 아래에 직경 1센티미터의 롤러를 놓아 현미경 테이블에 대해 45도 기울어짐을 유지합니다. 그 다음 고정 카테터를 수술로 열린 목 부위에 위치시켜 동물의 쇄골 부위에 위치시키고, 생리식염수 공급을 켜서 열린 목 공간을 생리식염수 용액으로 채웁니다.

목 부위에 생리식염수로 채워진 보호 케이스를 내리어 림프관이 시야 중앙에 위치하도록 합니다. 그 후 압력을 가하지 않고 기관에 보호 케이스를 덮어주세요. 마지막으로, 비수중 2광자 렌즈를 렌즈의 작동 거리에 따라 적절한 깊이로 보호 케이스 안으로 내리고, 경추 림프관의 2광자 시각화를 수행합니다.

시술 후, 조직 내 에반스 블루 림프절 축적으로 깊은 경부 림프절의 성공적인 확인이 확인되었습니다. 경추 림프관 수축력에 대한 2광자 모니터링은 광생체조절 전후로 수행되었습니다. 광생체조절은 2개월 및 18개월 생후 마우스에서 유사한 강도의 경추 림프관 수축력을 유의미하게 증가시켰습니다.

정량적 분석 결과, 24개월 된 마우스에서 경추 림프관 수축력이 2개월 및 18개월 마우스에 비해 유의하게 낮았습니다. 하지만 2개월과 18개월 된 마우스 사이에는 값이 유의미하게 차이가 없었습니다. 광생물조절은 2개월 및 18개월 생후 생쥐에서 경추 림프관 수축력을 유의하게 증가시켰으나, 24개월 생 생쥐에서는 효과가 없었습니다.

주사 후 4시간 후 경추 림프관에서 오른쪽 외측심실에 주입된 적혈구가 관찰되었고, 5시간 후에도 내강을 통해 계속 이동하여 뇌에서 말초로 방향성 있는 흐름이 확인되었습니다. 저희 프로토콜은 최대 5시간 동안 수축성을 유지하면서 자궁경부 림프관 기능을 생체 내에서 모니터링할 수 있도록 돕습니다. 이 방법은 재현성이 우수하며, 다양한 2광자 현미경과 대물렌즈와 호환되면서도 최대 500마이크로미터 깊이의 고품질 이미지를 유지합니다.

이 기술은 뇌 배출 시스템의 생리학과 경추 림프관 기능을 연구하는 보편적인 도구가 될 가능성이 있습니다.