골 재생 및 스캐폴드 성능 평가를 위한 다중 모드 접근법

저희 연구는 다양한 생체재료가 재생 과정에서 뼈 구조에 미치는 영향을 평가합니다. 뼈 재생은 조직이 계층적으로 조직되어 있기 때문에 다중 규모 평가가 필요합니다. 이 프로토콜은 다양한 스케일에서 샘플을 분석할 수 있게 합니다.

우선, 이식된 생체 물질이 포함된 수지가 박힌 경골을 표본 홀더에 고정하고 기구 팔에 부착합니다. 샘플을 원하는 단면 방향에 맞춰 정렬하세요. 저속 다이아몬드 톱 디스크를 구해 뼈를 약 0.7밀리미터 크기의 조각으로 절단합니다.

액체 저장소를 가득 채워 블레이드 하단 가장자리를 완전히 덮어줍니다. 샘플이 안정적이고 디스크 표면과 수평으로 정렬되어 있는지 확인하세요. 목표 절단 영역이 블레이드와 정렬될 때까지 위치 조절 노브를 사용해 시료 위치를 조정합니다.

시료를 더 빠른 속도로 절단하고 저압으로 움푹 들어갈 때까지 가하세요. 그 후 속도를 줄여 단면을 원활하게 완성하고 진동을 최소화하세요. 절단이 끝나면 즉시 톱을 멈추세요.

그 후 입체 현미경으로 절단된 샘플을 검사하여 장착합니다. 장착 시에는 내부에 고체 스테인리스 실린더와 외부 속이 빈 실린더로 구성된 자체 제작 조립체를 사용하여 연마 시 기계적 지지를 제공합니다. 다음으로, 내부 실린더를 핫플레이트 위에 올려놓고 약 120도에서 140도까지 가열합니다.

적절한 왁스를 선택하고 가열된 실린더 표면에 소량의 왁스를 바른 후 완전히 녹도록 하세요. 그 다음 관심 있는 표면이 아래를 향하도록 샘플을 왁스 코팅된 부분에 놓고, 녹은 왁스와 완전히 접촉하도록 부드럽게 눌러야 합니다. 그 다음 알루미늄 실린더를 핫플레이트에서 분리하고 왁스가 실온에서 굳도록 하세요.

거칠고 중간 연마를 위해서는 1, 200, 2, 500, 4, 100 정도의 사포를 선택하여 시료 두께를 약 0.15밀리미터로 줄이세요. 먼저 200방 사포를 사용하고, 2,500방 사포를 가볍게 가해 사용하세요. 연마 중 반사 현미경을 이용해 주기적으로 시료 두께를 모니터링하세요.

목표 두께에 도달하면 4개의 100방 사포로 샘플 양면을 연마합니다. 연마 단계마다 증류수로 샘플을 지속적으로 세척하세요. 최종 연마를 위해서는 시료 표면 거칠기에 따라 6마이크로미터 또는 3마이크로미터 입자 크기의 다이아몬드 페이스트를 선택하세요.

연마 디스크에 부착된 펠트 연마 천에 소량의 다이아몬드 페이스트를 바른 후 샘플을 연마합니다. 샘플을 실린더에서 분리하려면 왁스를 핫플레이트에 데우세요. 유닛을 핫플레이트에서 분리한 후, 실린더에서 샘플을 꺼내세요.

그 후 샘플 양면을 최소한의 압력으로 부드럽게 연마하고, 필터 페이퍼로 닦은 표면을 건조시킵니다. 현미경 분석 전에 샘플을 유리 슬라이드와 커버슬립 사이에 침지용 오일을 장착 매체로 사용하세요. 5배에서 10배 사이의 낮은 배율로 시작하여 편광 현미경을 사용해 콜라겐 섬유 배열을 관찰합니다.

마지막으로, 주사전자현미경 검사를 위해 샘플을 준비하여 뼈-생체물질 경계면을 더 분석합니다. 연마 및 초기 광학 현미경 검사 후, 고유 샘플 특징을 통해 광학 현미경에서 확인된 영역이 마이크로 컴퓨터 단층촬영 데이터셋의 해당 위치와 일치할 수 있었습니다. 편광 현미경 검사로 기존 뼈(파란색으로 표시됨)와 치유 중 새로 형성된 뼈(주황색으로 표현됨)를 구분했습니다.

고배율 편광 현미경 검사에서는 골이 기존 피질 뼈와 밀접하게 대조하여 자라는 경계면이 드러났으며, 얇은 영역에 수직 방향으로 배치된 제1형 콜라겐 섬유가 있었습니다. 주사 전자현미경 영상은 관심 영역의 정밀한 위치 파악을 가능하게 했습니다. 선택한 영역의 부피는 슬라이스 앤 뷰 단층촬영(슬라이스 앤 뷰 단층촬영)을 통해 추가로 조사되었습니다.

참호 면에는 성장하는 소상에서 뼈 형태가 나타났다. 투과 전자현미경은 골-생체물질 계면을 나노 규모로 관찰할 수 있게 하며, 이는 선택된 영역 전자 회절과 결합할 수 있습니다. 선택된 영역 전자 회절 패턴은 생체물질 영역과 뼈 영역 모두 하이드록시아파타이트 결정으로 구성되어 있음을 나타냈다.

영상화된 계면 영역의 에너지 분산 X선 분광 매핑에서는 인과 칼슘이 관찰되었습니다. 이 다중 모달 워크플로우는 단일 영상 기법으로는 달성할 수 없는 상호 보완적인 통찰을 제공합니다. 이 워크플로우는 상당한 시간과 기술 전문성, 그리고 전문 계측 장비에 대한 접근성을 요구합니다.

기능적 상관관계, 장기적인 골 재형성, 생체재료 설계를 조사할 수 있습니다.