Name: 광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 배우세요 광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 현미경을 사용한 DNA-PAINT 전세포 초해상도 영상법. 복잡한 조명 장비 없이 단일분자 국소화 현미경을 구현하여 신경과학 연구의 심층 세포 구조 분석을 가능하게 합니다.

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산</td><td>머크&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>트롤록스</td></tr><tr><td>3,4-디하이드록시벤조산 &nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60번; Apo NA 1.49 대물렌즈</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDA 스핀 탈염 컬럼, 크기 배제 수지 포함 &nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>89882</td><td>2.4단계 제바 스핀 탈염 기둥</td></tr><tr><td>Accutase - 효소 세포 박리 배지</td><td>프로모션 셀</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>알파카 sdAb (1H1) 항GFP와 맞춤형 DNA 결합 (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>매시브 포토닉스</td><td>맞춤 제품</td><td>초파리용 안티GFP 나노바디</td></tr><tr><td>알파카 sdAb (1H1) 항GFP와 DNA를 결합한 것</td><td>매시브 포토닉스</td><td>대규모 태그-Q-FAST 안티-GFP - F3</td><td>NUP용 항GFP 나노바디</td></tr><tr><td>항알파 튜불린 (YL1/2)</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>항토끼 IgG</td><td>매시브 포토닉스</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex, 보조 SDAB F2</td><td></td></tr><tr><td>반 TCR&zeta; (6B10.2)</td><td>바이오레전드</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>머크&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>원뿔형 원심관 15 mL</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 원심관 50 mL</td><td>VWR 인터내셔널</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 소라</td><td>니콘</td><td></td><td>SDC-OPR 현미경</td></tr><tr><td>세포 정제용 크기 배제 수지(Sephadex G-25)로 스핀 컬럼을 탈염 처리하며;</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>11743309</td><td>브랜드: 시티바. 2.5단계 G-25 열</td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>머크&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 미디어</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 무수성</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp; (디티오스레이톨)</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>마크</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>글루타알데히드</td><td>세르바</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>머크&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>MP 생의학</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>말레이미드-PEG2-석시니미딜&nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>맥코이의 5A 미디어</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산)</td><td>머크</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 0.5 mL</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>에펜도르프</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>ND-원-W</td><td>나노드롭</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>시그마-올드리치</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>나노입자 90nm - 금</td><td>세포 진단</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>오르카 퓨전-BT CMOS 카메라</td><td>하마마츠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15070063</td><td>추신</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (1x 용액)</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>피어스 16% 포름알데히드 (w/v), 메탄올 프리</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>11586711</td><td>PFA</td></tr><tr><td>염화칼륨 &nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>그리고 nbsp; P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>프로토카테츄에이트 3,4-디옥시시아제 & nbsp;</td><td>머크&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>나트륨과 nbsp; 수산화물</td><td>피셔 사이언티픽 주식회사</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 항체</td><td>앱캠</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>트리스 버퍼</td><td>VWR 인터내셔널</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>트리톤&nbsp; X-100&nbsp; 그리고 nbsp;</td><td>VWR 인터내셔널</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>머크&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>초여과 원심 여과 장치, 100 kDa MWCO</td><td>머크&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>제조사: 아미콘 울트라</td></tr><tr><td>&mu;-슬라이드 8 웰 하이 유리 바닥</td><td>이비디</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-슬라이드 VI 0.5 유리 바닥</td><td>이비디</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 dna-paint를 통한 전세포 초해상도 영상

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

SDC-OPR 시스템의 초해상도 영상 능력을 입증하기 위해(그림 1A), 핵 기공 복합체(NPC)에 대한 DNA-PAINT 영상 실험(그림 1B)을 수행하여 평면 내 해상도를 평가했습니다17. 그림 1C 는 U2OS 세포에서 단량체 강화 녹색 형광 단백질(mEGFPs)으로 태그되고 DNA 결합된 항GFP 나노바인으로 표지된 뉴클레오포린 96(Nup96)의 대표적인 DNA 페인트 SDC-OPR 이미지를 보여줍니다. 확대된 패널은 NUP 하위 구조를 드러내며, 그림 1D 는 핵 기공의 예상 8배 대칭성과 일치하는 쌍을 이룬 Nup96 단백질(화살표로 표시됨)을 보여줍니다. 그림 1E에서는 Nup96 쌍 간의 유클리드 거리를 정렬하고 합산 이미지의 단면 히스토그램(n = 16쌍)을 그려 측정했습니다. 분석 결과 피크 간 분리 거리는 (13 ± 2) nm(그림 1E)가 나타났으며, 이는 전자기(EM) 모델과 HILO 및 TIR 영상23의 결과와 일치하였습니다. 각 피크 맞춤은 4 nm의 표준편차를 보여주었으며, 이는 SDC-OPR에서 DNA-PAINT를 사용해 달성한 높은 위치 정밀도(σSMLM = 3.3 nm, NeNA = 4.4 nm)를 확인시켜 주었습니다. 특히, 이 정밀도는 53 × 53 μm² FOV 전체에서 유지되어 공초점 기반 시스템에서는 매우 예외적인 성과입니다.
다색 영상 능력을 입증하기 위해 Nup96, 미토콘드리아, U2OS 세포 내 미세소관을 DNA 표지하여 Exchange-PAINT18을 사용해 획득했습니다. 이 기술은 단일 형광체에 결합된 직교 DNA 이미저 가닥을 사용하여 동일한 레이저 광원으로 모든 표적을 여기시킬 수 있게 합니다(그림 2A). 신호를 동시에 획득하는 대신, 순차적인 영상 라운드에 걸쳐 신호를 분리하여 상업용 SDC-OPR 시스템에 쉽게 통합할 수 있게 합니다. 그림 2B 는 파란색으로 항GFP 나노바인으로 표지된 Nup96, 빨간색으로 미토콘드리아에 2차 항-TOM20 항체가 표시되어 있으며, 초록색 미세소관과 1차 항-α-튜불린 항체가 표시되어 있습니다. 특히, 단일 색상 Nup96 영상에서 얻은 뛰어난 단일 분자 위치 정밀도는 다중 표적 실험의 모든 표적에서 유지되어, NPC는 3.9 nm, α-튜불린은 4.0 nm, 미토콘드리아는 3.3 nm의 위치 정밀도를 얻었습니다(그림 2B 패널 1, 2, 3).
광야각(FOV) 이미징을 위해 HeLa 셀 내 미세소관은 SDC-OPR 시스템에서 제공하는 다양한 배율과 카메라 비닝 설정을 결합하여 78nm에서 108nm 사이의 픽셀 크기를 유지하도록 영상화했습니다(그림 3). 그림 3A는 10개의 HeLa 세포의 미세소관 세포골격을 보여주며, 색상은 위치 정밀성을 나타냅니다. 1× 배율에서는 평균 위치 정밀도가 높은 배율에 비해 눈에 띄게 떨어지며(그림 3B-D), 변동성이 더 큽니다. 이는 넓은 시야각에서 레이저 출력 밀도가 낮아지기 때문인데, 가우시안 조명 프로파일이 뚜렷해지면서 시야각 가장자리로 갈수록 정밀도가 떨어집니다. 그럼에도 불구하고, 광범위한 211 × 211 μm² FOV에서 평균 9.5 nm의 위치 정밀도를 달성한 것은 공초점 기반 시스템으로서는 인상적이며 생물학적 이질성에 대한 고해상도 조사를 가능하게 합니다.
마지막으로, 고정된 HeLa 세포의 미세소관 네트워크(공초점 두께 ~500 nm, z-단계 1 μm)를 시스템의 최고 배율(4×, 53 × 53 μm² FOV)으로 획득함으로써 전체 세포를 이미징할 가능성이 입증되었습니다. 그림 4A 는 각 z-평면의 단일 분자 재구성 이미지와 해당 국소화 정밀도 및 NeNA 값을 보여줍니다. 또한, 그림 4C에는 HeLa 세포 내 미세소관 네트워크의 3D 컬러 시각화가 제공되어 있습니다. 깊이가 증가할수록 산란과 광학 수차로 인해 검출되는 광자의 수가 감소하여, 크라메르-라오 하한(CRLB)(그림 4A, 오른쪽)에서 유도된 정지와 NeNA 지표로 계산된 위치 정밀도 모두 감소합니다. 그럼에도 불구하고 SDC-OPR 시스템이 가능한 높은 수준의 광자 수집 덕분에SMLM ≤ 최대 9 μm 깊이와 좁은 분포를 가진 10 nm σ 가능합니다. 실제로 이중 벽 필라멘트 미세소관 구조는 다양한 깊이에서 명확히 해명되었는데, 커버슬립-셀 경계면 근처, 중간 축 위치, 그리고 세포 상단에서 피크 투 피크 거리는 30 nm에서 40 nm 사이였으며(그림 4C), 보고된 값24와 일치한다. 이 결과는 SDC-OPR이 넓은 시야각과 셀 전체 높이에 걸쳐 고해상도 영상을 제공할 수 있음을 강조합니다.
<img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
그림 1: 다양한 세포 샘플의 평면 내 단일 분자 위치 현미경 및 다색 초해상도 영상. (A) 광자 재배치를 위한 스피닝 디스크 공초점 및 광자 재할당(SDC-OPR) 시스템의 개략도, 광자 수집을 극대화하기 위해 설계된 마이크로렌즈 배열이 특징입니다. (B) DNA 페인트 개략: 형광 표지된 DNA 가닥인 이미저 가닥은 상보적인 DNA 서열(도킹 가닥)과 일시적으로 하이브리드화하여 해당 단백질을 표적으로 하는 항체/나노바디에 고정됩니다. 이러한 단명한 결합 이벤트는 확률적 깜빡임으로 나타나는 형광 신호를 생성합니다. (C) U2OS 셀의 NPC를 4× 배율로 SDC-OPR 시스템에서 대표적인 DNA-PAINT 이미지를 촬영한 것. 고해상도 기능은 삽입 영상에서 개별 NPC가 명확하게 드러납니다. (D) SDC-OPR 강화 DNA-PAINT는 단일 NPC를 시각화할 수 있게 하며, 흰색 화살표가 구멍 구조 내 특징적인 Nup96 단백질 쌍을 강조합니다. (E) 단일 NPC 대칭 단위 내에서 Nup96 다이머(n=16쌍) 간 거리 측정 분포. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a> 
<img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
그림 2: SDC-OPR 현미경을 이용한 다색 영상 교환 PAINT. (A) 순차적으로 이미징된 세 대상의 Exchange-PAINT 도식. 세 가지 단백질 표적은 DNA 기능화된 항체, Fab 조각 또는 나노바디로 표지되었습니다. Cy3B 이미저 가닥은 가닥 유형별로 순차적으로 촬영되었으며, 이미징 라운드 사이에 워시 단계가 있었습니다. (B) SDC-OPR 현미경(4×배율)을 이용한 U2OS 세포의 3색 교환-PAINT 영상, 미세소관(빨간색; DNA 결합 항α-튜불린으로 표기됨), 미토콘드리아(녹색; TOM20 표적 DNA 나노바디), 그리고 NPC(파란색; mEGFP 태그 Nup96과 항GFP DNA 나노바디)를 포함합니다. 스케일 바: 5 μm. 확대된 영역은 SDC-OPR 시스템에서 얻은 향상된 해상도를 강조하며, (1) 미토콘드리아, (2) 미세소관, (3) NUP에 초점을 맞춥니다. 스케일 바 = 1 μm. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
그림 3: SDC-OPR 현미경에서 광시야(FOV) 내의 DNA-PAINT 이미징. 마이크로튜뷸 DNA-PAINT 이미지(안티-α-튜불린 표지)는 여러 배율로 획득: (A) 1×배율 및 1번의 비닝(시야각 211 × 211 μm²), (B) 2.8× 및 2 비닝(시야각 76 × 76 μm²), (C) 4× 배율과 4 비닝(시야각 53 × 53 μm²). 색상은 1배 배율의 경우 0-16 nm, 나머지 경우에는 0-4 nm의 위치 정밀도를 나타냅니다. (D) FOV 중심에서 μm 단위로 측정한 위치 정밀도는 1×(빨강), 2.8×(노랑), 4×(초록) 배율. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>
<img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
그림 4: 전세포 DNA-PAINT 이미징. (A) 왼쪽. SDC-OPR을 사용해 4× 배율로 획득한 HeLa 세포 내 체적 미세소관 영상으로, z = 0에서 9 μm(1 μm 단계)의 축 단면을 보여줍니다. 각 평면은 z 위치, 위치 정밀, NeNA 지표를 표시합니다. 스케일 바: 5 μm (xy). 맞아. 모든 비행면에 대한 위치 정밀도와 관통 깊이의 차이. (B) (A)에서 작성된 것과 동일한 HeLa 셀 위의 미세소관 네트워크의 3D 렌더링. 색상은 0에서 9 μm까지의 관통 깊이를 나타냅니다. (C) 각 관투 깊이에서 강조된 작은 영역의 확대 이미지. 이 수치는 Zaza 등14에서 수정된 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.</a>

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

저희 프로토콜은 회전 디스크 공초점 현미경에서 광학 광자 재할당을 통해 깊이 제한을 극복하는 DNA-PAINT를 사용합니다. DNA-PAINT는 다중화 및 정량적 기능을 통해 PALM, STORM 등 다른 SMLM 기법을 능가하는 매우 높은 해상도를 달성합니다. 우선, 광학 광자 재할당 장치와 sCMOS 카메라가 장착된 회전 디스크 공초점 시스템을 사용하세요.영상 촬영 30분 전에 현미경, 카메라, 레이저를 켜서 시스템을 시작하세요. 그다음 컴퓨터를 시작하세요. NIS-Elements 소프트웨어가 완전히 로드될 때까지 기다리세요.이제 획득 매개변수를 설정하기 전에 NIS-Elements에서 SoRa Spinning Disk를 선택하여 적절한 영상 모드를 선택하세요. 단일 분자 사건 검출을 극대화하려면 60x Apo 수치 개구 1.49 오일 침수 대물렌즈를 선택하세요. 그 다음, 대물렌즈, 카메라 설정, 샘플을 바탕으로 적절한 배율을 선택하세요.선택한 배율에 맞게 카메라 굴절을 조절하세요. DNA-PAINT 획득 노출 시간을 설정하세요. 이제 레이저 파장, 레이저 파워, 필터 휠을 이미저 염료 스펙트럼에 맞게 설정하세요.대물렌즈 후 레이저 출력을 기록하려면, 시료면 근처 현미경 스테이지에 보정된 레이저 파워미터 센서를 설치하고 측정된 출력을 기록합니다. 다음으로, 깨끗한 60x Apo 수치 구경 1.49 오일 대물렌즈에 침수 오일 한 방울을 바르세요. 준비된 면역염색 세포 샘플을 스테이지 어댑터를 사용해 현미경 스테이지에 고정하여 드리프트를 최소화합니다.밝은 시야 모드로 전환하고 나노입자를 기준으로 유리면에 집중하세요. 그 다음 퍼펙트 포커스 시스템을 활성화해 획득 중에도 집중력을 유지하세요. 퍼펙트 포커스 시스템이 활성화된 상태에서 녹색 형광 단백질 채널의 여기를 일시적으로 변경하여 최적의 초점면을 식별합니다.이 단계에서는 레이저 출력을 낮게 사용하세요. 실험 이름과 저장 경로를 정의하세요. 시간 박스를 체크하면 간격, 소요 시간, 루프 수를 설정하세요.구간을 No Delay로 설정하고 총 프레임 수에 해당하는 루프 수를 입력하세요. 하단의 PFS 박스가 선택되어 있는지 확인하세요. 이전에 정의한 SoRa 여기 설정으로 돌아가 '지금 실행'을 누르세요.첫 번째 단백질에 대해 300밀리초 통합 시간을 사용해 15,000에서 20,000 프레임을 획득합니다. 이미지 분석을 위해 디컨볼루트된 이미지 스택을 피카소 국지화 모듈에 로드하세요. 메뉴 바에서 분석(Analyze)을 선택한 후 파라미터(Parameters)를 선택한 후 제조사 사양에 따라 카메라별 파라미터를 입력하세요.다음으로, 박스 측면 길이를 7로 설정하여 단일 분자 위치 정밀도를 최적화합니다. 적절한 최소 순 기울기 값을 선택하고 미리보기를 활성화하여 감지된 현지화를 시각화하세요. 배경 감지를 최소화하기 위해 그라디언트 임계값을 조정하세요.이제 분석(Analysis)을 선택한 후 로컬라이즈(Localize)를 선택하여 모든 프레임에서 스팟 식별과 적합을 시작하세요. 생성된 hdf5를 Picasso Render 모듈에 불러와 재구성된 현지화 지도를 시각화합니다. Postprocess를 선택한 후 RCC로 Undrift를 선택하세요.1,000부터 시작하는 초기 분할 값을 입력하면 xy 드리프트 플롯을 얻습니다. 더 낮은 세그멘테이션 값으로 반복하여 드리프트 보정을 개선합니다. 렌더 모듈을 닫기 전에 파일 및 로컬라이제이션 저장을 클릭해 드리프트 보정 로컬라이제이션 파일을 저장하세요.이제 표류 보정 파일을 Picasso 필터 모듈에 불러와, 위치 정밀도, 점 확산 함수 너비, 광자 수 및 기타 품질 지표를 기반으로 임계값을 적용합니다. 필터 모듈을 닫기 전에 File과 Save Localization을 클릭해 필터링된 로컬라이제이션 파일을 저장하세요. U2OS 세포에서 단량체 강화 녹색 형광 단백질로 태그된 뉴클레오포린 96의 DNA-PAINT 이미징은 시야 전역에 명확하고 초분해상화된 핵 복합체 패턴을 생성했습니다.확대 뷰는 핵 기공의 예상 8배 대칭으로 배열된 쌍 뉴클레오포린 96 소단위체를 확인했다. 정렬된 뉴클레오포린 96쌍 간의 유클리드 거리 측정에서는 피크 간 거리가 13 ± 2 나노미터로 나타났습니다. 뉴클레오포린 96, 미토콘드리아, 미세소관이 모든 표적에서 단일 분자 위치 정밀도를 유지한 상태로 U2OS 세포에서 동시에 시각화되었습니다.광시각 HeLa 세포 내 미세소관 이미징은 위치 정밀도가 배율과 장 크기에 따라 달라지며, 낮은 배율에서는 정밀도가 감소함을 보여주었습니다. 더 높은 배율은 1배 배율에 비해 더 향상되고 균일한 위치 정밀성을 제공했습니다. 전체 세포 영상은 세포 깊이 전체에 걸쳐 여러 축 평면에 걸쳐 미세소관 네트워크를 DNA-PAINT로 획득함으로써 입증되었습니다.위치 정밀도는 영상 깊이가 증가함에 따라 점차 감소했습니다. 이중 벽 미세소관 구조는 30나노미터에서 40나노미터 사이의 피크 투 피크 거리를 가진 여러 축 위치에서 해명되었습니다. 우리 프로토콜은 간단하고 상업적으로 구할 수 있는 광학 장치를 사용하여 해상도를 희생하지 않고 심부 세포 및 조직 DNA-PAINT 이미징을 달성합니다.고해상도 DNA-PAINT는 주로 TIRF 또는 고조광 환경에서 작동하며, 영상 깊이를 몇 마이크론으로 제한합니다. 우리의 연구 결과는 DNA-PAINT를 많은 실험실에서 쉽게 접근할 수 있게 하여 세포와 조직에서 심층에서 나노스케일 영상을 가능하게 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

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Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

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여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

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기저막은 발달 동안 조직 및 장기 형태 형성에 필수적입니다. 이 구조의 적절한 배치로 이어지는 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 제시된 프로토콜은 공초점 및 초분해능 현미경을 사용하여 상피 세포에서 기저막 단백질의 세포 내 밀매 및 분비를 시각화하고 특성화하는 방법을 설명합니다.

초 파리 Oogenesis 동안 양극화 된 세포 내 밀매 및 기저막 단백질의 분비의 공초점 및 수퍼 해상도 이미징

초고해상도 현미경은 감수 분열의 시냅톤 복합체 내 구성 요소 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 Caenorhabditis elegans synaptonemal 복합체의 개별 단백질을 해결하기위한 프로토콜을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans 생식계열 내 시냅톤 복합체의 초고해상도 현미경

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초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

배우세요 광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 현미경을 사용한 DNA-PAINT 전세포 초해상도 영상법. 복잡한 조명 장비 없이 단일분자 국소화 현미경을 구현하여 신경과학 연구의 심층 세포 구조 분석을 가능하게 합니다.

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