Name: LC-MS/MS를 이용한 1차 ALL 세포 내 빈크리스틴 세포내 정량을 위한 외부 체외 미세법 개발 및 표준화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 학습하세요 LC-MS/MS를 이용한 빈크리스틴 정량법으로 소아 ALL 세포 내 약물 축적을 분석하는 방법을. 이 기술은 임상 약물 모니터링 정확도를 향상시켜 치료 효과를 최적화합니다.

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2.0 mL 나사 뚜껑 바이알</td><td>유량 공급</td><td>8-2400</td><td>같은 회사의 스프링이 달린 유리 인서트(5 x 29 mm)와 함께 사용됨 (카탈로그 5-29015)</td></tr><tr><td>2.0 mL 나사 뚜껑 바이알</td><td>유량 공급</td><td>8-2400</td><td>같은 회사의 스프링이 달린 유리 인서트(5 x 29 mm)와 함께 사용됨 (카탈로그 5-29015)</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>목표 V</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>크로마토그래피 시스템 Acquity UPLC H-클래스</td><td>워터스 컴퍼니</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>백작부인 3 FL</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 50 mL</td><td>사르스테트</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>개미산</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>유리병</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브 1.5 mL</td><td>에펜도르프</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>마이크로튜브 2.0 mL</td><td>에펜도르프</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>머크 (시그마-알드리치)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>피셔 사이언티브</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집용 소프트웨어</td><td>워터스 컴퍼니</td><td>매스링크스</td><td></td></tr><tr><td>삼중 쿼드러폴 질량분석기 Xevo TQ-S 마이크로</td><td>워터스 컴퍼니</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>초음파 음파기</td><td>퀴미스</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>빈블라스틴 1 mg/mL</td><td>립스</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>빈블라스틴 황산염</td></tr><tr><td>빈크리스틴</td><td>케이맨 케미컬스</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms/ms를 이용한 1차 all 세포 내 빈크리스틴 세포내 정량을 위한 외부 체외 미세법 개발 및 표준화

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

VCR과 VINB를 함께 배양한 1차 ALL PDX 세포를 이용한 세포 내 축적 분석 후 얻은 대표적인 크로마토그래피 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 샘플은 조건당 2.5× 10개의6셀을 사용해 준비되었습니다. 기술된 크로마토그래피 조건 하에서 VCR은 2.85분으로 일관되게 유지되며 매트릭스 효과가 최소화되었고, 피크 형태는 대칭적이고 잘 해명되었습니다. 이 프로파일들은 프로토콜이 올바르게 실행되었을 때 VCR과 VINB의 예상되는 크로마토그래피 거동을 보여줍니다.
이 프로토콜을 원발성 백혈병 세포에 적용하기 전에, 방법의 선형성, 검출한계(LOD), 최적 세포 수 및 배양 시간을 결정하기 위한 예비 분석이 수행되었습니다. 이 단계들은 본 프로토콜에 자세히 다루어져 있지 않으나, 보정 곡선의 대표적인 결과가 방법 검증의 일부로 아래에 제시되어 있습니다.
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LC-MS/MS를 이용한 1차 ALL 세포 내 빈크리스틴 세포내 정량을 위한 외부 체외 미세법 개발 및 표준화

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

우리의 목표는 임상적으로 관련된 샘플에서 빈크리스틴 내 세포 내 측정과 약물 세포 상호작용을 조사하는 것입니다. 현재 실험적 과제는 모델 전반에 걸친 인큐베이션 시간을 최적화하는 것입니다. 또한, 모델 의존적 약물 편의는 특히 1차 환자 샘플에서 견고성을 제한합니다.우선, 37도 섭씨의 증류수가 담긴 비커에 바이알을 부드럽게 돌려 냉동 보존 세포 샘플을 해동하여 내용물이 완전히 해동될 때까지 합니다. 바이알 내용물을 멸균 일회용 파스퇴르 피펫을 사용해 멸균 일회용 1X PBS 15밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 300G로 설정한 원심분리기에 실온에서 5분간 넣으세요.원심분리 후에는 튜브를 한 번의 부드러운 동작으로 뒤집어 상청액을 버립니다. 이제 일회용 파스퇴르 피펫을 사용해 세포 펠릿을 10밀리리터 AIM V 배지에 다시 현탁하세요. 자동 계수기를 사용해 생존 가능한 세포를 세고 평균 세포 크기를 측정합니다.측정된 세포 농도를 기반으로 한 단순 비율을 사용해 2.5 곱하기 10의 생생한 세포 6개의 제곱을 얻기 위해 필요한 부피를 계산합니다. 사용 전에 빈크리스틴 스톡 용액을 Vortex 사용하세요. AIM V 미디엄을 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣고, 2.5 곱하기 10 x 6 셀의 거듭제곱을 한 뒤, 필요한 빈크리스틴 용액을 추가합니다.잠시 소용돌이를 하고 튜브를 5초간 돌려 캡에서 액체를 모으세요. 다음으로, 열린 마이크로 튜브를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 3시간 동안 배양합니다. 배양 후에는 튜브 뚜껑을 닫고 샘플을 300G에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.피펫으로 상정액을 조심스럽게 버리세요. 그 다음 실온에서 PBS 1밀리리터를 튜브에 넣으세요. 원심분리와 세척 과정을 반복한 후, 피펫으로 남은 상원액을 조심스럽게 제거하세요.펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 다시 현탁시키고, 완전히 재현탁될 때까지 소용돌이로 만드세요. 이제 0.1 마이크로몰라 빈블라스틴이 포함된 냉메탄올 400마이크로리터를 영하 20도 섭씨에서 샘플에 직접 첨가하면서 튜브 벽과 접촉하지 않도록 합니다. 샘플은 영하 80도에서 하룻밤 보관하세요.원심분리기를 섭씨 4도까지 예식한 후 영하 80도 냉동고에서 샘플을 꺼내세요. 냉동실에서 샘플을 꺼낸 직후, 13,000G에서 4도 섭씨에서 20분간 원심분리합니다. 그 후 피펫을 사용해 1.5밀리리터 마이크로튜브에 상청액 300마이크로리터를 옮깁니다.샘플을 45도 섭씨로 설정한 진공 농축기에 1시간 40분간 넣어 완전히 건조시킵니다. 건조 후 각 펠릿을 0.1%의 개미산이 함유된 400마이크로리터의 물에 피펫을 사용해 다시 현탁합니다. 펠릿이 완전히 녹을 때까지 부드럽게 소용돌이를 돌립니다.이제 샘플을 13,000G에서 4도 섭씨에서 20분간 원심분리합니다. 상청액 300마이크로리터를 2밀리리터 스크류 상단 바이알에 옮겨 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법 분석합니다. 소프트웨어 홈 화면에서 샘플 목록을 열고 샘플 이름, 주입 부피, 바이알 위치, 사용 방법을 입력하여 새 목록을 생성하세요.초순수수가 담긴 바이알을 오토샘플러 트레이에 넣고, 이 바이알을 샘플 목록에서 빈칸으로 지정합니다. 블랭크는 3회 주사 사이마다 사용해서 이월을 방지하세요. 샘플 목록에서 원하는 행을 선택하고 실행을 클릭한 후 확인 버튼을 누르고 데이터 수집을 시작하세요. 검사가 끝나면 결과 중에서 샘플을 선택하여 상단 메뉴 바의 크로마토그램을 클릭하여 크로마토그램을 확인하세요.마지막으로 홈 화면에서 '타겟 링크'를 클릭하세요. 방금 실행된 파일을 선택하고 프로세스 버튼을 클릭하세요. 빈크리스틴 방식을 선택하고 확인을 클릭하면 출력 표를 생성합니다.1차 급성 림프모세포 환자 유래 이종이식 세포를 1미세소구 빈크리스틴으로 3시간 배양한 크로마토그래피 분석 결과, 2.85분에 대칭적이고 잘 분명한 VCR 피크가 나타나 적절한 보존과 최소한의 기질 간섭을 확인하였습니다. AIM V 매체에서 생성된 빈크리스틴의 보정 곡선은 0.001에서 10 마이크로몰라까지 농도에서 강한 선형성을 보였다. 마찬가지로, 2 곱하기 10의 6 RS4; 11개의 세포가 추가되었고, 0.01에서 1개의 소대구니까지 선형 반응이 관찰되었습니다.빈크리스틴 축적에 대한 시간 분석 결과, RS4; 11개 세포는 빈크리스틴과 빈블라스틴 비율에서 2시간에서 3시간 사이에 정체기를 보였으며, 4시간과 5시간에서 소폭 증가한 반면, 1차 PDX 세포는 2시간에 정점을 찍고 이후 감소하여 3시간을 균형 잡힌 배양 시간으로 선택했다. 정규화된 빈크리스틴 축적량은 6개의 PDX 환자 샘플에서 변동했으며, 빈블라스틴 비율에 의한 비정규화된 빈크리스틴과 평균 세포 부피 사이에는 양의 상관관계가 관찰되었습니다. 파편화 분석 결과, 빈크리스틴의 기본 피크가 413.38의 전구체 이온과 일치함을 확인했으며, 이는 40볼트 콘 에너지와 16볼트 충돌 에너지 하에서 392.47의 정량 이온과 383.38의 확인 이온을 생성했다.우리 프로토콜은 간접적 접근법의 한계를 극복하여, 주로 백혈병 세포에서 직접적이고 민감한 세포내 약물 측정을 가능하게 합니다. 저희 접근법은 세포 내 빈크리스틴의 직접 측정을 가능하게 하며, 세포 투표율이 낮더라도 이를 가능하게 합니다. 앞으로 세포내 약물 축적량의 차이가 시험관 내성과 연관되는지 조사하고 관련 기전을 탐구할 예정입니다.

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그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

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