쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

우리는 줄기세포에서 유래한 아이렛을 이용해 인간 내분비 췌장 발달을 연구하여 당뇨병의 유전적 기초를 이해하고 있습니다. 전통적인 신장 캡슐 이식은 매우 침습적입니다. 근육 내 이식 프로토콜은 더 간단하고 재현 가능하며 최소 침습적인 대안을 제공합니다.

시작하려면, 24웰 마이크로웰 플레이트 바닥에 역피라미드 마이크로웰이 포함된 5% 반부착 용액 0.5밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 1,300g 원심분리기로 실온에서 10분간 보관하세요. 그 다음 미세한 구멍에서 공기 방울이 있는지 검사하세요.

플레이트를 다시 원심분리한 후, 갇힌 공기를 제거하기 위해 반접착 용액을 흡입합니다. 그 후 각 웰을 0.5밀리리터의 PBS로 세척한 후 세척 과정을 한 번 반복합니다. 다음으로, hPSC에서 발달한 배양된 췌장 전구세포를 0.5밀리몰라 EDTA를 포함한 1밀리리터의 PBS로 세척합니다.

PBS에 0.5밀리몰라 EDTA를 흡입하고 웰을 트립신으로 덮으세요. 그 후 37도 섭씨에서 8분에서 12분간 부화시킵니다. 트립신을 DMEM/F12 또는 PBS 2부피로 희석한 후 피펫팅으로 세포를 부드럽게 재현탁합니다.

서스펜션을 원뿔형 튜브로 옮기고 즉시 다음 단계로 넘어가세요. 현상액을 200g에서 실온에서 3분간 원심분리하세요. 상원액을 조심스럽게 흡입한 후 펠릿을 미리 예열한 S4 매체에 부드럽게 다시 부유하세요.

다음으로, 마이크로웰 접시에서 PBS를 흡인하세요. 마이크로웰 플레이트의 각 웰에 부유 셀 1.25밀리리터를 부드럽게 첨가합니다. 100g 원심분리기를 실온에서 3분간 원심분리하여 마이크로웰 내 세포를 고르게 분포하세요.

마이크로웰 플레이트를 조심스럽게 가습 인큐베이터로 옮기세요. 분화 매체로 매질 변화를 수행하려면, 우물 벽을 따라 매질을 부드럽게 흡입하고 분사하여 난류와 마이크로웰에서 세포 군집이 이동하는 것을 방지합니다. 적절한 양의 생성된 클러스터를 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 옮긴 후, 주사기를 바늘 튜브 조립체에 연결하고 S7 매체를 채웁니다.

클러스터를 마이크로 원심분리기 튜브에서 직접 튜브로 흡입하세요. 튜빙을 반으로 접고 접힌 부분을 200마이크로리터 피펫 팁에 삽입하세요. 그 후 팁 튜빙 바늘 어셈블리를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 삽입하고 끝을 테이프로 튜브 테두리에 고정합니다.

튜브를 100g에서 4도 섭씨에서 2분간 원심분리하여 클러스터를 압축한 후 즉시 얼음 위에 올려놓으세요. 마취된 NOD scid gamma 마우스에 클러스터를 이식하기 위해, 오른쪽 다리 무릎 아래 내측을 면도하고 70% 에탄올로 소독합니다. 그 다음 튜브를 피펫 팁에서 분리해 주사기에 연결하세요.

다져진 클러스터 근처에 튜브를 잘라서 바늘의 둔한 끝에 연결하세요. 첫 번째 뭉치가 바늘 끝에 닿을 때까지 식염수를 밀어 넣습니다. 그 다음 마우스를 엎드린 자세로 오른쪽으로 기울이고 오른쪽 다리를 뻗으세요.

바늘을 내전근과 경근 사이 오른쪽 허벅지 내측 구획에 4밀리미터에서 5밀리미터 깊이 삽입합니다. 그 후 바늘을 약 3밀리미터 당기면서 클러스터를 주입합니다. 주사기를 돌리고, 바늘을 빼고, 쥐가 회복할 시간을 주세요.

이식 후 6주 후 이식 후 회복 및 조직 절절 수술 후, 이후 영상 분석을 위해 면역염색을 실시합니다. 4기 췌장 전구세포의 단일 세포 현탁물을 마이크로웰 플레이트에 삽입하여 크기가 조절된 3차원 집합체를 생성했습니다. 24시간에서 48시간 이내에 조밀한 구형 군단이 형성되었습니다.

형광 현미경 검사에서 보고자 hPSC 라인에서 PDX1과 인슐린 발현 세포가 존재함을 확인하였습니다. 6주 후, 이식 부위는 근육 내에서 고리와 같은 덩어리로 확인된 것으로 확대되었습니다. 절제 후 입체 현미경으로 구분된 식물들은 연한 구형 결합 구조로 식별되었습니다.

이식 동물에서 C-펩타이드 양성 세포의 견고한 검출이 관찰되었습니다. 인슐린 염색 검사 결과, 이식편 내에 인간 베타 유사 세포가 존재함을 확인했습니다. 글루카곤과 소마토스타틴 양성 세포가 검출되어 알파 및 델타 세포 집단이 보존되었음을 나타냈습니다.

이 프로토콜은 이식된 인간 이식편의 생체 내 기능적 검사와 생존 및 성숙 평가를 용이하게 합니다. 가장 중요한 고려사항은 고품질의 줄기세포 분화와 클러스터 형성 시 부드러운 세포 취급을 보장하여 생존력을 극대화하고 좋은 세포 생존을 보장하는 것입니다. 이 모델들은 단일유전자 당뇨병과 베타세포 기능 장애의 유전적 메커니즘을 탐구하는 데 도움을 줍니다.