MLV 기반 가성바이러스를 이용한 SARS-CoV-2 진입 억제제를 잠재적 항바이러스제로 식별하는 절차

저희 연구는 가짜 바이러스 시스템을 이용해 SARS-CoV-2 진입을 차단하는 억제제를 규명하는 데 중점을 두고 있습니다. SARS-CoV-2 진입 연구는 보통 BSL-3 수준의 고도의 생물안전 격리 실험실이 필요합니다. 이 프로토콜은 표준 BSL-2 실험실에서 가성바이러스에 사용되는 안전한 항바이러스 선별을 가능하게 합니다.

먼저, 6웰 조직 배양판을 생물안전 캐비닛에 놓고, 웰당 5개의 HEK 293 유래 세포 5제곱에 7.5 곱하기 10제곱 단위로 완전 배지 2밀리리터에 씨앗을 뿌립니다. 플레이트를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 하룻밤 부양하세요. 다음 날, 세포들이 약 50%에서 60% 합류율에 도달했는지 확인하세요.

다음 날, 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에 1밀리리터 PEI 육수당 1밀리리터 5마이크로리터를 50마이크로리터 환원 혈청 배지에 첨가하여 폴리에틸레니민 또는 PEI 용액을 준비합니다. 별도의 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관에서 플라스미드 발현 GFP 2.5마이크로그램을 50마이크로리터 같은 배지에 첨가하여 DNA 용액을 준비합니다. 각 튜브를 잠시 소용돌이 방식으로 섞은 후 5초간 회전시키고 실온에서 배양합니다.

10분 잠복 기간 동안, 세포 단층을 손상시키지 않고 6웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고, 항생제가 전혀 없는 완전 형질염화 배지 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 배양 후에는 PEI 용액이 담긴 튜브에 DNA 용액 50마이크로리터를 첨가합니다. 피펫팅으로 6번 빠르게 섞고, 상온에서 정확히 3분간 배양하세요.

그 후 PEI DNA 복합체를 해당 우물에 빠르게 드롭 단계로 추가합니다. 이제 플레이트 가장자리를 파라필름과 원심분리기로 밀봉하고, 스윙 로터와 플레이트 버킷을 사용해 1000G 원심분리기를 실온에서 30분간 끊지 않고 밀봉합니다. 원심분리 후에는 파라필름을 부드럽게 제거하고 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 3시간 동안 배양합니다.

그 후 각 웰의 트랜스펙션 배지를 2밀리리터의 사전 예열 완전 DMEM 매개체로 부드럽게 교체합니다. 형질전환된 세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 48시간 배양하고, 형광 현미경을 이용해 GFP 발현을 평가하여 형질전환 효율을 평가합니다. 앞서 보인 것처럼 HEK 293T 유래 세포를 두 개의 6웰 플레이트에 씨앗합니다.

한 판은 SARS-CoV-2 스파이크 가짜 바이러스 생성용으로, 다른 한 판은 VSVG 가짜 바이러스용으로 지정합니다. 실험 당일에 트랜스펙션 믹스와 PEI DNA 복합체를 준비하고 실온에서 10분간 배큐하세요. 배양 중에는 세포 단층을 손상시키지 않고 6개의 웰 플레이트 각 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하세요.

각 웰에 항생제 없이 미리 가열된 완전 형질염화 배지를 천천히 1밀리리터 첨가하여 배지가 웰 벽을 따라 흐르도록 합니다. 준비된 형질전환 복합체를 세포에 추가하여 이전에 보여준 대로 형질전환합니다. 형질전환 후 48시간 배양 후, 각 웰에서 상청액을 50밀리리터 멸균 원뿔 원심분리관에 담아 290G에서 4도 섭씨에서 7분간 원심분리합니다.

세포 없는 상청액을 수집하여 멸균된 0.45마이크로미터 폴리비닐리덴 플루오라이드 상단 병 필터 유닛으로 필터링합니다. 여과된 상청액을 1밀리리터 알리코트로 준비하여 영하 80도 씨앗 2.5 곱하기 10의 제곱 제곱인 HSI 씨앗(HSI 세포 4개 제곱)에 50마이크로리터의 완전한 DMEM을 96웰 조직 배양판에 보관합니다. 검사할 각 조건(스파크리스 가성 바이러스 감염과 비감염 대조군 포함)에 대해 3중판 우물을 준비하고 라벨을 붙이세요.

플레이트를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 하룻밤 부양하세요. 전도하는 날에는 각 가짜 바이러스 배치의 알리코트를 얼음 위에 올려 해동하고, 스파이크리스 대조군 알리코트 하나를 포함해 부드럽게 역전하여 혼합합니다. 지정된 웰에 필요한 양의 가짜 바이러스 준비물을 직접 추가하세요.

각 우정의 부피를 완전한 DMEM으로 150 마이크로리터로 조정하세요. 이제 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 원심분리기로 2,500G에서 실온에서 45분간 중단 없이 보관하세요. 파라필름 봉인을 제거하고 5% 이산화탄소와 함께 37도 섭씨에서 72시간 배양합니다.

배양 후에는 제조사의 지침에 따라 루시퍼라제 분석제를 준비하세요. 루시퍼레이스 기질과 5X 루시퍼레이스 분석 용해 버퍼를 실온에서 10분에서 15분간 해동합니다. 5X 루시퍼라제 분석 용해 버퍼를 멸균수에 1X 희석합니다.

조심스럽게 흡취하고 상정액을 버리세요. 다음으로, 각 웰에 1X 용해 버퍼 30마이크로리터를 추가합니다. 접시를 접시 셰이커에 올려놓고 실온에서 분당 150회전으로 10분간 흔듭니다.

거꾸로 현미경으로 세포가 완전히 용해되어 구별이 불가능한지 확인하기 위해 완전한 세포 용해를 검증하세요. 그 다음 용해물을 불투명한 흰색 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 50마이크로리터의 루시퍼레이스 기질을 추가합니다.

판을 부드럽게 원을 그리며 잠시 섞은 후 판을 광도계에 넣고 광도를 측정하세요. 앞서 설명한 대로 96웰 플레이트에서 웰당 50마이크로리터의 완전한 DMEM에 2.5 곱 10의 HSI 셀 4제곱 씨앗을 시드합니다. 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 하룻밤 배양하세요.

다음 날에는 0.5%디메틸 황산화물을 함유한 완전한 DMEM에 아르비돌과 같은 화학물질을 1회에서 3회 연속 희석 상태로 준비합니다. 멀티채널 피펫을 사용해 각 웰에서 매지를 부드럽게 흡입하세요. 각 웰에 해당 조석액 50마이크로리터를 첨가하고, 완전한 DMEM만 컬럼 12 대조 웰에 추가합니다.

5% 이산화탄소와 함께 37도에서 1시간 동안 부양하세요. 화합물을 제거하지 않고, 동일한 화합물 농도가 포함된 완전한 배지에 희석된 각 배지에 SARS-CoV-2 스파이크 유사 바이러스 50마이크로리터를 직접 첨가합니다. 플레이트를 파필름으로 밀봉하세요.

2,500G에서 실온에서 45분간 원심분리기를 쉬지 않고 보관합니다. 파르필름을 제거한 후, 플레이트를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 72시간 배양합니다. 마지막으로, 앞서 보여준 루시퍼레이스 분석법을 사용해 감염도를 정량화합니다.

PEI가 가지된 HEK 293T 유래 세포의 형질전환은 높은 형질전환 효율을 보여 약 70%의 GFP 양성 세포를 얻었습니다. 형질전환 후 48시간 후. 감수성 HSI 세포에 SARS-CoV-2 스파이크 가짜 바이러스 또는 VSVG 가짜 바이러스 감염은 가짜 바이러스 투입이 증가할수록 선량 의존적으로 발광이 증가하는 것을 보였다.

스파이크가 적은 가짜 바이러스와 감염되지 않은 세포는 매우 낮은 발광 수준을 보였습니다. 아르비돌 화합물은 가짜 바이러스 침투 억제 능력이 시험되었으며, 스파이크 가짜 바이러스가 생성하는 루시퍼라제 활성을 명확히 용량 반응 억제하였으나 VSVG 가짜 바이러스에서는 억제 효과가 더 낮게 관찰되었습니다. 분석 결과 Z 프라임 인자가 0.54로 선별에 적합함을 나타냈습니다.

30마이크로몰라부터 시작한 농도의 아르비돌 치료는 0.5% 디메틸 설옥사이드 매개체만 사용한 세포에 비해 세포 생존성에 유의미한 영향을 미치지 않았습니다. 이 프로토콜은 최적화된 조건을 통해 고역가 가짜 바이러스를 생산할 수 있게 했습니다. 이를 통해 연구자들은 가짜 바이러스 진입을 측정하고 SARS-CoV-2 스파이크 매개 감염을 억제하는 화합물을 식별할 수 있습니다.

높은 형질전환 효율은 고역가 가짜 바이러스를 생성하고 후속 분석에서 신뢰할 수 있는 감염 신호를 얻는 데 매우 중요합니다. 이 시스템은 SARS-CoV-2 변이체에 대한 고처리량 항바이러스 스크리닝과 진입 억제제의 평가절하를 지원하며, 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질을 나타내는 의사 바이러스를 생성하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다.