CUT&RUN을 이용한 신경내분비 소세포폐암 세포주에서 히스톤 변형 및 전사인자 결합 부위의 전면 지도 작성

따라서 우리 연구의 목표는 다양한 소세포폐암 유형에서 계통을 정의하는 전사 인자와 염색질 재형성 단백질 간의 상호작용을 규명하고, 이러한 상호작용이 암의 시작 및 진행을 포함한 질병 과정에 어떻게 기여하는지 규명하는 것입니다. 우리는 CUT&RUN과 같은 실험을 통해 이를 달성하는 것을 목표로 합니다. CUT&RUN은 차세대 시퀀싱 기법으로, 이러한 차별적으로 변형된 히스톤과 DNA 결합 전사인자의 유전체 위치를 전 지구적으로 프로파일링하거나 식별할 수 있습니다. 궁극적으로, 우리는 이 매우 공격적인 폐암 환자에 대한 새로운 치료법 개발에 있어 치료적으로 실행 가능한 후생유전학적으로 조절되는 새로운 경로를 규명하기를 희망합니다.

우선, 37도 인큐베이터에서 배양된 소세포폐암 신경내분비 세포를 꺼내 현미경으로 검사하여 품질을 확인합니다. 그 후 셀 현탁액을 50밀리리터 원뿔 튜브로 옮기고, 1,200g 압력에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 후드의 진공을 이용해 원뿔형 튜브에서 배지를 흡입한 후, 생성된 세포 펠릿을 20밀리리터의 PBS로 헹군습니다.

튜브를 1,200g에서 다시 5분간 원심분리한 후 PBS를 흡인하세요. 아큐타제를 페릿 크기에 따라 첨가하고 37도 섭씨에서 3분에서 5분간 배큐하여 세포 펠릿을 소화합니다. 다음으로, 10% FBS가 포함된 PBS 5밀리리터를 첨가하여 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 소화를 종료합니다.

앞서 보인 대로 세포를 다시 원심분리한 후, 펠릿을 PBS 5밀리리터에 재현탁합니다. 자동 셀 카운터를 사용해 시작 셀을 세고 생존 가능성과 무결성을 확인하세요. 필요한 총 셀 수를 계산하고 피펫팅 오류를 반영하기 위해 20%의 초과분을 더하세요.

계산된 총 셀 수를 1.5밀리리터 튜브에 옮기고, 실온에서 600g에서 3분간 원심분리합니다. 세포를 워시 버퍼 내 5 곱하기 10의 5 세포 거듭제곱으로 재현탁하여 총 6회 반응을 시도합니다. 반응당 100마이크로리터의 버퍼를 사용하고, 피펫을 부드럽지만 철저하게 사용해 균일한 현탁을 보장합니다.

세포를 다시 원심분리하고 상원액을 제거한 후 세척을 반복하세요. 세척된 세포 100마이크로리터를 8개 스트립 세트의 각 튜브에 100마이크로리터의 활성화된 콘카나발린 A 구슬을 담습니다. 피펫으로 부드럽게 피펫으로 내용물을 섞으세요.

비드 셀 슬러리를 실온에서 10분간 배양하여 세포가 비즈에 결합하도록 하고, 튜브를 미니 원심분리기에서 빠르게 돌려 비드가 가라앉지 않도록 슬러리를 수집합니다. 진공관을 0.2밀리리터 튜브 자석 거치대에 올려놓으세요. 슬러리가 맑아질 때까지 기다린 후 피펫으로 상원액을 제거하세요.

그다음 자석에서 튜브를 분리하세요. 즉시 각 반응마다 50마이크로리터의 얼음 차가운 항체 버퍼를 추가하고, 부드럽게 피펫으로 비드를 재현탁시킵니다. 8개의 스트립 튜브에 적절히 라벨을 붙이세요.

각 반응관에 각각 0.5마이크로그램의 H3K4me3, H3K4me1, 면역글로불린 G 항체와 다양한 출처에서 추출한 E2F7 다클론 항체 0.6마이크로그램을 첨가합니다. 각 반응관의 내용을 부드럽게 피펫으로 섞고, 튜브 캡을 올린 채 4도 섭씨의 뉴테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 뉴테이터에서 8개의 스트립 튜브를 제거하고 각 튜브 바닥에 액체를 모으기 위해 빠르게 돌립니다.

이제 튜브를 자석 받침대 위에 올려놓고 슬러리가 맑아질 때까지 기다립니다. 그 후 피펫으로 상정액을 제거하고 버리세요. 튜브를 자석 스탠드에 올려놓고, 각 튜브를 200마이크로리터의 냉전지 투과성 완충제로 두 번 세척한 후, 세척 후 다중 채널 피펫으로 상원액을 제거합니다.

다음으로, 자석 스탠드에서 튜브를 분리하세요. 즉시 각 반응에 50마이크로리터의 냉기 투과성 완충제를 추가하고, 피펫으로 세포와 비즈를 부드럽게 부탁합니다. 그 다음 각 반응에 2.5마이크로리터의 단백질 AG-미세코칼 뉴클레아제를 첨가하고 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞습니다.

상온에서 10분간 부화 후 튜브를 빠르게 돌려 돌립니다. 슬러리가 맑아질 때까지 다시 자석 스탠드 위에 올려놓은 후 상환액을 제거하세요. 구슬을 차가운 세포 투과성 버퍼로 두 번 세척한 후, 50마이크로리터의 투과성 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다.

튜브를 얼음 위에 올려놓은 상태에서, 이전 단계의 8개 튜브 스트립에서 각 반응마다 100밀리몰라 염화칼슘 1마이크로리터를 추가하세요. 피펫을 부드럽게 사용해 구슬을 완전히 재현지시키고 효율적인 소화를 촉진하세요. 튜브를 4도 섭씨 온도에서 2시간 동안 부양하며, 튜브 캡을 높이 유지하세요.

이제 새로운 1.5밀리리터 튜브에서, 33마이크로리터의 정지 버퍼와 1마이크로리터의 대장균 스파이크를 결합하여 반응당 0.5나노그램의 대장균 스파이크를 결합하여 정지 버퍼 혼합물을 준비합니다. 용액을 부드럽게 소용돌이로 섞으세요. 2시간 배양이 끝나면, 각 반응관에 준비된 정지 버퍼 혼합물 33마이크로리터를 첨가하고 충분히 혼합합니다.

반응관을 37도 섭씨에서 열순환기에서 10분간 배양하세요. 빠르게 돌린 후, 튜브를 자석 선반에 올려 용액이 맑아질 때까지 보관하세요. CUT&RUN 방출 DNA가 포함된 상청액 약 85마이크로리터를 신선한 1.5밀리리터 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.

회수된 DNA를 정제하고, 양을 평가하며, 품질 관리를 위해 조각 크기 분포를 수행합니다. 그 다음 CUT&RUN 라이브러리 준비, 정량화, 인덱스 라이브러리 풀링, 페어드 엔드 차세대 시퀀싱을 진행합니다. 아카에테-스큐트 상동체-1 고세포주인 DMS79와 H146, 그리고 신경원분화 인자 1 고세포주에서 H82는 부유 상태에서 비부착 집합체 또는 조밀한 구형 형태로 성장했으며, H446은 약 80%가 고유 세포, 20%가 현탁 상태로 혼합된 형태를 보였다.

CUT&RUN DNA 조각 분석 결과, 강화제 히스톤 마크 H3K4me1이 모든 세포주에서 가장 높은 DNA 양을 보였고, 그 다음이 H3K4me3, E2F7과 IgG가 가장 낮은 양을 보였습니다. 추출된 CUT&RUN DNA의 경우, H3K4me1과 H3K4me3의 조각 크기 분포에서 단핵체와 디뉴클레오좀, 그리고 게놈 DNA에서 명확한 피크가 나타났습니다. 반면, E2F7이나 IgG 대조군에서는 뚜렷한 피크가 검출되지 않았습니다.

낮은 DNA 입력에도 불구하고, E2F7과 IgG를 포함한 모든 CUT&RUN 표적에 대해 차세대 시퀀싱 라이브러리가 성공적으로 구축되었습니다. DMS79 야생형 및 H146 이형접합 돌연변이 세포에서의 열지도 분석에서는 H3K4me3와 E2F7 신호가 전사 시작 부위 근처에서 풍부하게 보인 반면, H3K4me1 신호는 더 넓게 분포되어 있음을 보여주었다. 무작위로 선정된 염색질 영역에서 유전체 브라우저 시각화 결과, H3K4me3, H3K4me1, E2F7에서 뚜렷한 봉크가 나타났으나, IgG는 농축이 없었습니다.

전통적으로 과학자들과 연구자들은 염색질 면역침전을 거쳐 시퀀싱 또는 ChIP-seq를 사용하여 우리가 묻는 질문들을 해결해 왔습니다. 하지만 ChIP-seq는 상당히 많은 입력 물질을 필요로 하는데, 이는 사용되는 모델에 따라 항상 실현 가능한 것은 아닙니다. 반면 CUT&RUN은 입력 자료가 훨씬 적게 필요하며, 최대 50,000 셀에 불과하고, 고처리량 시퀀싱 읽기 횟수도 적어 비용이 적게 들고, 데이터 생성 시 배경 생성도 훨씬 적습니다.

CUT&RUN은 2D 배양 세포뿐만 아니라 환자 유래 오가노이드나 이종이식편과 같은 다른 전임상 모델에도 적용할 수 있는 기술입니다. 또한 정상 및 병든 조직을 포함한 조직의 염색질 지형을 프로파일링하는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 기술은 암 연구자들에게 매우 유용한 기술일 뿐만 아니라, 다양한 인간 질환을 연구하는 비암 연구자에게도 매우 유용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 히스톤 변형과 세포 게놈 내 다양한 단백질의 고정 프로필을 매핑할 수 있게 합니다. SCLC 아형에 걸쳐 히스톤 PTM과 TF 결합을 제공하면 증강제와 슈퍼증강제와 같은 아형별 표적 유전자와 조절 요소를 발견할 수 있습니다.