현지화된 RNAi과 약용 거머리의 이소성 유전자 발현

약용 거머리는 구조가 단순하고 접근성이 좋으며, 초기 배아 발생 단계부터 노년기에 이르기까지 다양한 실험 도구를 통해 정적인 식별 뉴런을 관찰할 수 있어 신경생물학 연구에 유용한 모델 시스템입니다. 특히 배아 거머리의 매우 흥미로운 활용 방안은 연구 대상 뉴런이나 그 표적의 유전자 발현을 매우 정밀하게 수정하여, 살아있는 온전한 동물 내에서 뉴런 성장 과정을 타임랩스 이미징으로 연구하는 것입니다. 본 영상에서는 Alex Grossman 연구실과 본 연구실의 공동 연구로 개발된 공압식 모세관 건(pneumatic capillary gun)을 사용하여, 살아있는 거머리 배아의 내부 층으로 시약을 빠르고 정확하며 매우 국소적으로 전달하는 새로운 기술을 선보입니다.

이 기술은 DNA, 이중 가닥 RNA 또는 미세 금 입자에 적재할 수 있는 다른 모든 분자의 전달에 적용될 수 있지만, 여기서는 Axon guidance molecule인 Rin의 넉다운(knockdown)과 넉인(knockin) 모두에 사용할 것입니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스 생명과학부의 Eduardo Ano 연구실 소속입니다. 오늘은 초파리 모든 체절의 배측 영역에서는 발현되지 않고 복측 체벽에서만 자연적으로 발현되는 Axon guidance molecule networking의 발현을 넉다운하거나 넉인하는 절차를 보여드리겠습니다.

발달 초기 단계에서 선택한 마디의 체벽과 신경절에 이중 가닥 RNA 또는 플라스미드 DNA 분자를 전달하겠습니다. 공압 모세관 건(pneumatic capillary gun)을 이용한 전체적 전달은 하위 마디의 특정 영역에서 유전자 발현 패턴을 교란할 수 있게 하며, 처리하지 않은 마디를 내부 대조군으로 남겨둘 수 있다는 점에서 특히 중요합니다. 또한, 조직에 손상을 주거나 표본을 절개하지 않고도 발달 초기 단계의 세포 내부층에 도달하는 데 사용할 수 있습니다.

마지막으로, 전신 전달 방식은 미세주입을 통한 단일 세포 녹다운과 유전적 접근법을 통한 전신 녹다운의 중간 단계로서, 선택된 위치의 제한된 수의 세포를 표적화할 수 있다는 장점이 있습니다. 이제 시작해 보겠습니다. 약용 LE는 중추신경계의 단순함, 즉 약 200쌍의 양측성 뉴런과 소수의 거대 글리아 세포로 구성되어 있다는 점 때문에 신경 세포의 특성과 행동 관련 신경 회로를 연구하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다.

21개 신체 마디의 각 분절 신경절과 거머리의 각 뉴런은 초기 배아부터 성체에 이르기까지 개체 간에 반복적으로 식별하고 연구할 수 있습니다. 파라오 시대부터 거머리는 사혈 목적으로 사용되어 왔으며, 의학 분야에서 지속적으로 사용되고 있어 상업적 동물 공급업체를 통해 쉽게 구할 수 있습니다. 하지만 우리는 신경계 발달을 연구하기 때문에, 실험에 필요한 배아를 안정적으로 공급받고자 실험실에서 수백 마리 규모의 거머리 사육 군집을 유지하고 있습니다.

거머리는 자웅동체입니다. 암수 모두의 생식 구조를 가지고 있으며 교차 수정합니다. 따라서 모든 개체가 알을 낳을 수 있습니다.

이들은 고치라고 불리는 구조물 안에 알을 낳으며, 이 고치는 클로아카(cloaca)라고 알려진 신체 부위에서 매우 흥미로운 폴리머를 분비하는 특수 샘을 통해 스스로 만들어냅니다. 알을 낳을 준비가 된 거머리는 수조에 제공된 이끼 속으로 파고 들어가 몸 주변에 달걀 모양의 고치를 형성하기 시작합니다. 충분한 양의 물질이 분비되고 분자가 중합되기 시작하면, 거머리는 고치 내부에 알과 영양분이 풍부한 노른자를 낳은 후 몸을 꿈틀거려 빠져나옵니다. 면도날을 사용하여 고치 끝부분에 창을 내어 절개함으로써 배아를 제거할 수 있습니다.

일반적으로 각 고치에는 분화가 시작된 후 약 6일째부터 10~20개의 배아가 포함되어 있습니다. 배아는 고치에서 꺼내어 연못물에서 배양할 수 있습니다. 보통 이 단계에서 신경 발달에 관한 실험적 연구를 시작합니다.

이 절차의 첫 번째 주요 단계는 코팅된 입자를 준비하는 것입니다. 본 시연에서는 lech 상동체의 축삭 유도 분자 rin의 이중 가닥 RNA 분자로 코팅된 금 입자를 lech 배아 내로 전달하는 방법을 보여드리겠습니다. 표적 세포는 체벽의 복측 종성 근육 세포이며, 이 세포들은 Agenesis 초기 단계부터 Rin을 발현하고 방출하는 것으로 알려져 있습니다.

본 실험의 목표는 발달 초기 단계에서 단일 체절의 자연 발현을 억제하고, 이러한 중요한 발달 인자에 민감한 뉴런의 분류에 어떤 영향을 미치는지 관찰하는 것입니다. 이 단계에서는 초음파 세척기, 볼텍스 믹서, 벤치탑 원심분리기 및 아이스 버킷이 필요합니다. 또한 100% isopropanol이 필요하며, 이는 사용 전 얼음 위에 놓아 냉각시켜야 합니다.

mL당 50 mg의 vault 입자가 포함된 바인딩 버퍼 100 µL로 시작합니다. 이 입자들은 RNAi용으로 설계되었으며 chell사에서 제조되었습니다. 다음으로, 바인딩 버퍼 100 µL를 추가하여 입자 용액을 희석하고, 짧게 볼텍싱한 후 1~2분 동안 초음파 처리하여 응집되었을 수 있는 입자들을 분리합니다.

2분간의 동기화 후, 5~10 µg의 이중 가닥 RNA를 입자에 추가하고 볼텍싱한 뒤 실온에서 2분 동안 둡니다. 2분이 지나면 마이크로 원심분리기를 사용하여 최소 2,500 RPM에서 약 15초 동안 이중 가닥 RNA-입자 복합체를 원심분리합니다.

pt를 얻기 위해, 펠렛이 최대한 흐트러지지 않게 주의하며 상층액을 제거하고 750 µL의 isopropanol을 첨가합니다. 마이크로 원심분리기로 짧게 원심분리한 후 상층액을 제거하거나, 소니케이션을 통해 금 입자를 100% 차가운 isopropanol에 현탁시킵니다. 입자를 분리하기 위해 배스 소니케이터에서 2~3회 짧게 펄스로 처리합니다.

유리 슬라이드 위에 붓고 용매가 완전히 증발하도록 둡니다. 입자를 조직에 전달하기 직전에 코팅했을 때 가장 좋은 결과가 얻어지며, 다음 단계에서 그 방법을 보여드리겠습니다. 정전기적 transfection을 수행하기 전에, 실험 설정과 준비 방법을 살펴보겠습니다.

배아 내로 입자를 정확하게 전달하기 위해 공압식 모세관 건을 마이크로 조작기에 장착합니다. 비디오 현미경으로 배아의 표면을 촬영합니다. 반도체 레이저가 건의 내부 모세관을 통해 광선을 생성하며, 이를 사용하여 표적 조직을 조준합니다.

건 헤드의 3개 입구에 연결된 각각의 Titan 튜브 라인을 통해 단일 소스로부터 가압 헬륨 가스가 공급됩니다. 한 라인은 항상 열려 있어 건을 통해 헬륨 가스가 지속적으로 흐르게 합니다. 다른 두 라인은 평소에 솔레노이드 밸브로 닫혀 있으며, 튜브 내부에 로딩된 두 가지 서로 다른 코팅의 금 입자를 포함하고 있습니다.

건조 분말 형태로 준비합니다. 건(gun)의 외부 모세관은 게이지 압력이 -12.5 PSI인 진공 시스템에 연결됩니다. 원하는 입자 침투 깊이를 조절하기 위해 hi의 헤드 압력을 10에서 15 PSI 사이로 변경합니다.

헬륨 헤드 압력은 입자의 침투 깊이에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 배아와 건(gun) 사이의 거리 또한 마찬가지입니다. 유전자 건마다 서로 다른 노즐 직경은 표적 영역에 맞추어 적절히 선택하는 것이 중요합니다. 이제 실험 장치 구성을 살펴보았으므로, Jing gun에 시료를 장착하고 거머리 배아에 쏘아보겠습니다.

Titan 튜브를 장착하기 전에, 코팅된 금 입자가 완전히 건조되었는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 우선 커버 슬립이나 면도날을 사용하여 유리 슬라이드에서 코팅된 금 입자를 긁어내어 접은 유청지(whey paper)에 넣을 준비를 합니다. 입자를 장착할 때 튜브 전체로 퍼지지 않고 커넥터 근처에 집중될 수 있도록, 커넥터와 가까운 쪽의 튜브를 U자 형태로 구부려야 합니다.

작은 스패튤라나 V자 모양의 칭량지를 사용하여 입자를 떠낸 후 튜빙에 채웁니다. 채우는 과정에서 손가락으로 튜빙을 톡톡 쳐서 입자가 고르게 퍼지도록 합니다. 튜빙을 채운 후 이제 진 건(Jing gun)으로 이중 가닥 RNA를 전달할 수 있지만, 그 전에 거머리를 준비해야 합니다.

여기 약 10일 된 거머리 배아를 볼 수 있습니다. 배아들은 현재 멸균 배지에 들어 있으며, 이 배지는 이중 가닥 RNA를 주입하기 전과 후에 계속 사용됩니다. 실험용 배아의 이중 가닥 RNA 주입을 준비하는 첫 번째 단계는 V자형 홈이 있는 평평한 유연한 실리콘 조각에 멸균 배지로 희석한 8% ethanol 용액을 추가하는 것입니다.

입자 투사 직전에 배아 하나를 추가하고 복측이 위로 향하도록 배치합니다. 챔버 내의 배지는 배아의 상단 표면 바로 아래까지 낮추고, 중앙에 작은 구멍이 뚫린 티슈 페이퍼 조각을 그 위에 올려 배아를 고정하고 표면이 마르는 것을 방지하는 동시에, 오늘 사용할 배아 단계에서 표적이 될 영역만 노출되도록 합니다. E 10 단계의 경우, 종근 세포는 표피, 진피 및 환상근 내부의 외측 표면에서 약 10 내지 20 µm 떨어진 곳에서 찾을 수 있습니다.

배아 단계(본 실험에서는 E7에서 E12까지 사용)의 배아 복측에 위치한 중추 신경절은 근육 세포와 달리 체벽 복측 표면에서 약 50 µm 내부에 위치합니다. 신경절보다 더 얕은 깊이에서 발견되는 종근(longitudinal muscles)을 대상으로 하기 위해 헬륨 압력을 조절하겠습니다. 이제 금 입자로 종근에 샷을 쏠 준비가 되었습니다.

약 0.5 mg 무게의 금 입자 적재량은 일반적으로 최대 10회 분사까지 사용할 수 있으며, 한 번의 분사당 보통 수백 개의 입자가 전달됩니다. 분사는 밸브 중 하나를 0.3초 동안 짧게 열어 해당 튜브 라인에서 건 보어(gun bore)로 입자 덩어리를 주입함으로써 생성됩니다. 관심 조직 부위를 충분히 커버하기 위해서는 종종 여러 번의 분사가 필요합니다.

입자 일부를 떨어뜨려 건 보어(gun bore) 내의 연속적인 헬륨 흐름 속으로 원활하게 주입하기 위해, 샷 사이에 튜브를 가볍게 톡톡 칩니다. 동일한 분석에서 두 번째 시약을 전달하려는 경우, 금 입자 전달 직후에 두 번째 튜브에 다른 입자를 로드할 수 있습니다. 배아를 인공 연못물에 다시 넣고, RNAi 또는 외생적 발현(ectopic expression)이 충분하다고 판단될 때까지 가급적 디쉬당 하나의 배아를 배치하여 1~3일 동안 유지합니다.

이 시간 동안 배아는 실온의 암실에 보관됩니다. 여기는 narin, Mr.NA 넉다운에 대한 인시튜 하이브리다이제이션 분석 과정입니다. 처리된 배아에서는 소수의 근육 세포에서만 terrin이 발현되지 않는 것을 확인할 수 있습니다.

이 근육들은 입자들을 포함하고 있습니다. 입자들이 terrin 이중 가닥 RNA로 코팅되었을 때, 입자를 포함하는 세포(일반적으로 세포당 1~2개의 입자)에서만 narin 발현의 뚜렷한 넉다운(knockdown)이 일어나는 것을 확인할 수 있습니다. GFP를 인코딩하는 플라스미드로 입자를 코팅한 후, 우리가 사용하는 공압 모세관 건(pneumatic capillary gun)을 이용해 입자를 핵 안에 정지시키면 신경 세포에서 형광이 나타납니다.

본 시연을 통해, 표적 영역의 세포에 감지 가능한 손상을 입히지 않으면서 살아있는 배아의 작은 국소 부위 내 세포로 두 가지 입자를 모두 전달할 수 있었습니다. 또한, 노마딕 모세관 건(nomadic capillary gun)이 어떻게 전방위적 전달 기술을 구현하며, 조직의 3차원적으로 제한된 미세 영역 내에서 조직 손상 없이 정밀하게 표적화하여 유전자를 넉인(knock-in) 및 넉다운(knock-down) 시킬 수 있는 새로운 기능을 제공하는지 보여드렸습니다. 이것으로 마치겠습니다.

시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.