마우스의 근육 및 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태의 현장 정량화 방법
2026년 4월 10일
미토콘드리아 염료 표지 말단 미토콘드리아의 국소 주입 시 생 체 내 공초점 현미경 검사. 이 방법은 건강한 근육을 가진 쥐와 병든 쥐의 골격근 조직에서 입증된 개념 증명을 활용하여 고해상도 미토콘드리아 시각화를 제공합니다.
우리 연구는 처음으로 신경근 접합부의 말단 슈반 세포의 미토콘드리아 형태를 조사합니다. 저희 접근법은 모세혈관 및 림프층과 같이 얻기 어려운 조직에서 미토콘드리아 형태를 정량화할 수 있게 합니다. 우선, 야생형과 D2-mdx 마우스를 구하세요.
발가락 집는 반사로 마취 깊이를 확인한 후, 오른쪽 무릎 쪽 원위 힘줄에 바늘을 꽂습니다. 주사 경로를 따라 바늘을 빼면서 경골 내부, 즉 TA 근육에 2마이크로몰라 원적색 형광 미토콘드리아 염색액 50마이크로리터를 주입하고, 생체 내에서 1시간 동안 염색료를 배양합니다. 마취 상태에서 동물을 유지하면서 가위와 겸자를 사용해 안락사 전에 TA 근육을 해리하고 분리하세요.
분리된 TA 근육을 4% 파라포름알데히드에 실온에서 15분간 넣습니다. 그 후 입체 현미경으로 섬유를 부드럽게 분리해 살짝 떼어냅니다. 4% 파라포름알데히드에 세포 과잉 핵산 염색을 첨가하여 핵 표지에 사용할 최종 농도는 밀리리터당 5에서 10마이크로그램을 얻습니다.
그 후 TA 근육을 PBS로 세 번씩 각각 5분씩 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. 근육을 50%75%와 100% 에탄올에 차례로 5분씩 탈수하세요. 그 후 샘플을 조직 정화 용액 1번과 2번에 차례로 각각 30분씩 배양하여 완전히 잠기도록 합니다.
근육을 커버슬립 위에 올려놓으세요. 무게 7.8g의 2.5x2x1cm 유리 블록을 사용해 부드럽게 납작하게 만드세요. S100 베타 마우스를 구입하세요.
발가락 꼬집는 반사로 마취 깊이를 확인한 후, 대둔근(GM) 근육 위에 작은 피부 절개를 합니다. GM 근육 아래에 2미세소구 원빨간 형광 미토콘드리아 염색액 75마이크로리터를 주입하세요. 상처를 봉합하고 염료를 45분간 배양하여 말단 슈반 세포에 선택적으로 표지합니다.
마취 상태로 동물을 유지하면서 10분 이내에 GM 근육을 해부하고 즉시 차가운 0.9% 멸균 식염수에 넣으세요. D2-mdx 마우스를 사용할 때만 형광 아세틸콜린 수용체 염료를 1:500 희석 농도로 미세해부 욕조에 첨가하고 조직을 30분간 배양합니다. 과도한 지방과 결합 조직을 다듬고, GM 근육을 복측 쪽이 아래로 향하게 한 커버슬립에 옮겨 역현미경 검사를 하세요.
GM의 등쪽 표면에 일반 마운팅 매체 2마이크로리터를 추가하고, 이미징 전에 유리 블록으로 조직을 평평하게 만듭니다. 소프트웨어에서 여기 파장을 646나노미터로 설정하세요. 2번 제거액을 두 방울 떨어뜨린 후, TA 근육을 촬영할 63배 대물렌즈를 선택하고 Z 스택 깊이를 100마이크로미터 근처로 설정합니다.
그 후 디컨볼루션 모드를 선택하고 시스템 최적화 매개변수를 적용합니다. 스텝 크기를 1마이크로미터로 설정하고 이미지를 획득하세요. 말단 슈반 세포의 이미지를 획득하려면 20배 배율 대물렌즈를 선택하고 Z 스택 깊이를 약 17마이크로미터로 설정한 후 이미지를 획득합니다.
그 후 63배 배율 대물렌즈를 선택하고 개별 말단 슈반 세포의 이미지를 획득합니다. 개별 Z 슬라이스를 불러와 소프트웨어가 미토콘드리아 신호를 인식하도록 훈련시킵니다. 그리고 AI 기반 소프트웨어를 이용한 정량적 분석을 수행합니다.
조사관 검토를 위한 이미지 마스크를 개발하세요. 알고리즘 최적화 후 3D 이미지 스택을 개별 광학 섹션으로 분리합니다. 각 3D 이미지에서 5번째 Z 슬라이스마다 선택하고, 샘플당 평균값을 계산합니다.
모든 샘플에 걸쳐 영상 매개변수를 표준화하고, 미토콘드리아 형태를 정량화합니다. 면역조직화학 및 통계 분석을 수행하여 그룹 간 차이와 상관관계를 평가합니다. mdx 근육의 미토콘드리아 연결성은 야생형 쥐에 비해 감소했습니다.
mdx 마우스에서는 작은 미토콘드리아 조각의 수가 더 많고, 연결된 큰 미토콘드리아 네트워크의 수가 감소하는 것이 관찰되었습니다. 야생형 쥐에서는 말단 슈반 세포의 미토콘드리아가 분기점 근처에서 상호 연결된 고리 구조를 보였습니다. 반면 mdx 마우스에서는 분기점 근처에 분기된 고리 형성이 없고 단편화된 모습을 보였습니다.
공초점 현미경과 전자현미경 검사는 말단 슈반 세포에서 유사한 도넛 모양의 미토콘드리아 구조를 확인했습니다. 시냅스 후 분석 결과, 아세틸콜린 수용체 주변에 서브사르콜렘말 미토콘드리아가 모여 있는 것으로 나타났으며, 특징적인 프레첼 같은 구조가 결여되어 있었습니다. 영상 분석 결과, mdx 근육의 말단 슈반 세포 미토콘드리아는 야생형 근육에 비해 면적과 단편화가 증가했으며, 상대적 입자 크기에는 차이가 없다.
근력 측정 결과, 근육의 탈근육 경련은 감소했고 변동성이 더 크며, 최대 힘도 감소했습니다. 자극 빈도가 증가함에 따라 mdx 근육에서 힘 생성도 유의미하게 감소했습니다. mdx 근육은 섬유 크기가 왼쪽으로 이동하여 야생형에 비해 약 60% 더 작은 근섬유를 보였다.
이 프로토콜은 연구자들이 골격근과 말단 슈반 세포에서 미토콘드리아 형태를 연구하고 정량화할 수 있게 합니다. 향후 연구들은 이 접근법을 미세순환 및 림프관 내 미토콘드리아 형태학을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
