시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

우리의 목표는 기계적 신장이 세포 기능에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 저비용의 호버만 영감을 받은 현미경 호환 세포 신장 장치를 개발하는 것이었습니다. 이 장치는 연구자들이 심장 박동이나 호흡하는 폐와 같은 생리 시스템을 모방하여 기계적 자극에 대한 생명 세포 반응을 연구할 수 있게 합니다. 적절한 경우 개인 보호 장비부터 시작하세요.

실가드 184 베이스와 경화제를 플라스틱 접시에 10대 1 비율로 섞으세요. 혀압상기를 사용해 성분들을 2분에서 3분 정도 격렬하게 섞습니다. 그 후 접시를 배출실에 1시간 동안 넣습니다.

다음으로, 준비된 3D 프린팅 몰드에 PDMS 혼합물 1.3g을 등방성 몰드에 첨가합니다. 그 다음 유니 축 몰드에 PDMS 혼합물을 0.5그램 넣습니다. 젤을 몰드 전체에 고르게 펴 바르고 채워진 몰드의 가스를 한 시간 동안 제거하세요.

몰드 안의 젤을 실온에서 평평한 표면에 2시간 동안 가라앉히세요. 그 후 곰팡이를 60도 오븐에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 다음으로, NuSil 겔 8100의 A와 B 부분을 같은 비율로 혼합합니다.

결합된 젤을 실가드 184 가교제와 전체 부피의 0.36%로 혼합하여 기질 강성을 13킬로파스칼로 만듭니다. 0.3킬로파스칼의 강성을 가진 부드러운 기판을 만들려면 가교차 결합제를 추가하지 말고, 용액을 15분간 함께 돌려 혼합하세요. NuSil 혼합물을 제기실에 넣고 30분간 탈기를 합니다.

이제 맞춤 몰드에서 PDMS 젤을 조심스럽게 꺼내 40mm 커버 슬립에 찢어지지 않고 올려주세요. 다음으로 PDMS 젤을 스핀 코더에 넣으세요. NuSil 혼합물 100마이크로리터를 등방성 PDMS 겔의 음의 영역에 피펫 주입합니다.

그 후 50마이크로리터의 NuSil 혼합물을 유니얼 축 PDMS 겔의 음수 영역에 피펫팅합니다. 그 코드 후 7G에서 50초간 이어졌다. 두께 100마이크로미터를 달성하는 것.

코팅된 젤을 실온에서 평평한 표면에 2시간 동안 가라앉히세요. 젤을 오븐에 넣고 60도 섭씨에서 하룻밤 동안 경화시킵니다. 이제 탄성 세포 배양 웰에 인간의 기도와 평활근 세포를 씨앗 뿌리고 표준 조건에서 배양합니다.

그 후 세포를 FLIPR 칼슘 6 용액과 혼합하여 영상 촬영을 하세요. 견인력 측정을 위해 PDMS NuSil 겔 기판에 형광 구슬 층을 코팅하여 기준 표지로 활용하세요. HBSS에서 직경 1마이크로미터 적색 형광 카복실산 변형 미세구의 0.025% 용액을 준비합니다.

와류 믹서를 사용해 구슬 용액을 10초간 소용돌이로 만듭니다. 그 후 880마이크로리터의 비드 용액을 등방성 젤에 피펫으로 채웁니다. 유니 액시얼 젤에 비드 용액 420마이크로리터를 추가합니다.

젤을 실온에서 1시간 배양한 후, 구슬 분포를 유지하기 위해 조심스럽게 구슬 용액을 제거하세요. 그 후 면봉이나 실험실용 물티슈로 젤 표면에 남은 용액을 부드럽게 닦아내세요. 다음으로, 카메라, 라이트 엔진, 10배 건식 대물렌즈가 장착된 역현미경을 사용하세요.

여기 크기를 475 x 40 나노미터로, 방출 범위를 555 x 50 나노미터로 설정하세요. 스트레치 실험 중 2헤르츠 프레임 속도로 16비트 이미지를 획득합니다. 이제 등방성 젤을 스트레처에 올려놓고, 10배 건식 대물렌즈가 장착된 역현미경으로 형광 구슬을 촬영합니다. 사전 스트레치 상태에서 이미지를 캡처합니다.

스트레칭 프로토콜 전반에 걸쳐 기판 중심부에서 이미지를 지속적으로 촬영하세요. 필요하다면 이미지를 캡처하기 전에 현미경을 늘어난 위치에서 다시 초점을 맞추세요. 푸리에 견인력 현미경을 기반으로 한 맞춤형 MATLAB 코드를 사용하여 이미지를 분석하여 변위 벡터와 해당 평면 변형장을 계산합니다.

데이터를 최종 시험의 평균으로 표현하세요. 240마이크로미터 변위를 가하면 형광 구슬이 중심에서 방사형 방향으로 바깥쪽으로 이동했습니다. 견인력 현미경은 중심에서 바깥쪽으로 방사되는 등방성 변위장을 밝혀냈으며, 거리가 멀어질수록 크기가 증가하는 벡터가 나타났습니다.

등방성 변위장은 균일한 평면 변형 장을 생성했다. 변위를 1000마이크로미터로 늘리면 변위 벡터의 크기가 증가하면서 반경 방향을 유지하게 되었습니다. 1000마이크로미터에서 대응하는 변형장은 반경 대칭을 유지하면서 크기가 증가했습니다.

250마이크로미터 변위를 받은 단일 축 젤에서는 변위 벡터가 주로 단일 축을 따라 정렬되어 단일 축 변형과 일치하였다. 변형 파형은 프로그래밍된 모터 변위와 매우 유사하며 세 번의 반복 사이클에 걸쳐 동기화되었다. 최대 변위에서의 변형률 값은 세 개의 독립적인 샘플에서 일관성을 유지했습니다.

최대 5,555 마이크로미터의 일시적 변위를 가하면 0.1%에서 12% 이상의 변형이 생성되었습니다. 0.5% 변형이 일시적으로 작용하면 세포 내 칼슘 수치가 증가하여 신장 후 형광 강도가 높아지는 것으로 나타났습니다. 들것을 이용해 연구자들은 생세포 칼슘 영상, 견인력 현미경 촬영, 등방성 또는 단방향 축 신장에 대한 세포 기계적 반응을 정량화할 수 있습니다. 중요한 단계는 젤이 평평한 표면에서 경화되도록 하는 것입니다. 두께가 고르지 않으면 기판이 초점이 흐트러져 라이브 이미징 시 광학 선명도가 저하될 수 있기 때문입니다.

향후 연구들은 신장 유발 세포골격 재방향, 천식 또는 폐 손상과 관련된 병리적 긴장 상태, 그리고 다양한 세포 유형에 걸쳐 조사할 수 있습니다.