디지토닌 투과화된 BE(2)-C 신경모세포종 세포에서 산화적 인산화 결합의 콜린성 리간드 의존 조절

이 실험의 궁극적 목표는 선택적 투과화와 기질 억제제 조합을 사용하여 온전한 배양 신경모세포종 세포에서 미토콘드리아 생체에너지학을 평가하는 방법을 입증하는 것입니다. 전통적으로 미토콘드리아 호흡은 Oroboros O2K 고해상도 호흡계, 클라크형 산소 전극, Seahorse XF 분석기와 같은 기기를 사용하여 평가합니다. 조직이나 세포에서 분리되거나 농축된 미토콘드리아 분획에 의존하는 전통적인 방법은 종종 미토콘드리아 구조를 손상시킵니다.

예를 들어, 쥐 피질에서 분리된 미토콘드리아의 투과 전자현미경 이미지는 미토콘드리아가 시냅스 전 말단에 캡슐화되어 있는지에 따라 구조적 완전성에서 뚜렷한 차이를 보여줍니다. 시냅스 전 말단 내에 캡슐화된 미토콘드리아는 이 사진의 청록색 화살표에서 알 수 있듯이 구조적으로 온전해 보입니다. 반면, 막막이 덮이지 않거나 주변 막 구조가 없는 미토콘드리아는 노란색 화살표로 변형된 모습을 보입니다.

Seahorse Flex 분석기는 배양 세포와 분리된 미토콘드리아 모두에서 미토콘드리아 생체에너지학을 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다. 배양된 세포 기반 분석에서는 세포 구조와 신호 전달 네트워크가 보존됩니다. 그러나 온전한 세포의 원형질막은 많은 트리카복실산 사이클 기질에 불투과됩니다.

이로 인해 고립된 미토콘드리아에 비해 대사 분석 범위가 제한되는데, 미토콘드리아는 원형막 장벽이 없지만 구조적 인공물을 자주 보입니다. 따라서 두 시스템 모두 고유한 한계를 가지고 있습니다. 여기서 제시된 기술은 원형질막이 콜레스테롤이 풍부한 반면, 미토콘드리아 막에는 콜레스테롤이 거의 없다는 점을 이용합니다.

디토닌과 같은 콜레스테롤 결합 세제를 사용하면 미토콘드리아 막은 그대로 유지하면서 원형질막을 선택적으로 투과시킬 수 있습니다. 이 접근법은 소기관의 무결성을 해치지 않으면서도 미토콘드리아 기질과 억제제를 세포 내 통제된 침투로 허용합니다. 따라서 이 기법은 전체 세포 구조의 장점과 분리된 미토콘드리아 분석의 접근성을 결합하여 온전한 세포 맥락에서 미토콘드리아의 기능적 분석을 가능하게 합니다.

실험은 세포의 하위 융합 배양 접시로 시작하세요. 멸균 인산염 완충제로 세포를 부드럽게 세척하고, 적절한 양의 트리톤 용액을 넣어 세포 단층을 고르게 덮습니다. 배양 후에는 접시를 꺼내고 가로로 살짝 두드리거나 흔들어 세포를 분리하는 데 도움을 줍니다.

5ml 피펫과 피펫 컨트롤러를 사용해 셀 현탁액을 여러 번 위아래로 움직여 뭉치를 부수고 단일 셀 현탁을 달성합니다. 현미경으로 세포 현탁을 관찰하여 균일한 단일 세포 현탁임을 확인하세요. 혈액세포계나 자동 세포 계수기를 사용해 세포 수를 세세요.

100마이크로리터의 현탁액에 약 10,000개의 세포가 들어있도록 셀 농도를 조절합니다. Seahorse XF 분석판의 각 웰에 셀 현탁액 100마이크로리터를 조심스럽게 속도 조절합니다. 분석 중 배경 대조로 사용할 수 있도록 한 개의 우물을 비워두세요.

세포 배양 인큐베이터에서 2시간에서 3시간 동안 배양하여 세포가 웰 바닥에 달라붙도록 하세요. 세포가 부착되면, 각 웰에 300마이크로리터의 분석 배지를 부드럽게 첨가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 하룻밤 동안 배양하여 세포가 안정되고 성장할 시간을 주세요.

각 웰 바닥에 셀이 균일한 단층을 형성하도록 하세요. 과밀을 피하세요. 최적의 분석 성능을 위해 세포들은 과도하게 융합되 하지 않아야 합니다.

실험 전날 밤, 각 웰에 1ml의 보정 버퍼를 추가하여 XFp 24 센서 카트리지에 수분을 공급합니다. 또는 pH 7.4의 인산 완충 식염수를 사용할 수도 있습니다. 카트리지를 실온에 두고 침대 위에 하룻밤 두세요.

37도(섭씨)에서 비-COT 인큐베이터에서 배양할 필요는 없으며, 카트리지는 장전 과정에서 상온에 평형을 이루기 때문입니다. 모든 냉동 정액과 실온에서 미세아질분석 버퍼 2개를 호출하세요. pH를 확인해 보세요, 7.4여야 합니다.

필요하면 조정하세요. 모든 기질과 주입액을 준비하고 pH를 다시 확인하세요. 모든 용액은 사용할 때까지 얼음에 보관하세요.

센서 카트리지 주입 포트 용액을 위해 A, B, C, D로 표시된 식품 튜브를 준비하세요. 각 포트마다 억제제나 기판을 포함하는 용액을 만드는 것이 가장 좋습니다. 멀티채널 피펫을 사용해 각 주입 포트 용액 50마이크로리터를 각 포트인 A에서 D까지 조심스럽게 주입합니다.

실험 1시간 전부터 2시간 전에 Seahorse 바이오분석기를 시작하여 내부 인큐베이터가 섭씨 37도에서 안정화될 수 있도록 하세요. 각 웰에 라벨을 붙이고, 실험 설계와 Wave Desktop 2.6 가이드라인에 따라 그룹화하세요. 적절한 혼합 비율, 무게, 측정 주기에 맞게 바이오분석기를 프로그래밍하세요.

참고로 표 8을 참고하세요. 측정 주기 시작 시 평형 옵션을 비활성화하는 것이 중요합니다. 계속 붙여두면 실험이 불필요하게 길어지고 기질 자원이 고갈될 수 있습니다.

시작 기계가 먼저 센서 카트리지를 보정하는데, 이 과정은 약 15분이 소요됩니다. 센서 카트리지를 보정 후 바로 셀 플레이트 준비를 시작하세요. 각 웰에 부착된 세포마다 약 700마이크로리터 1x 미토콘드리아 분석액을 제거하지 않고 조심스럽게 흡입하고, 플레이트를 1분간 평형으로 두세요.

각 웰에서 버퍼를 조심스럽게 흡입하면서도 부착 세포를 방해하지 마세요. 와셔 단계를 세 번 반복해서 완전한 매체를 확보하세요. 동행적으로, 세포가 없는 배경 우물에 50마이크로리터의 미토콘드리아 분석 버퍼를 추가합니다.

반월판을 부피 일정을 시각적으로 참고하세요. 세포 내 웰에서 완충제를 조심스럽게 흡입하여 약 50마이크로리터를 남겨 세포 수분 유지를 유지하세요. 플레이트를 37도 섭씨에서 배양하라. 수면 위에 머무르거나, 증발을 막기 위해 포화된 대기가 있는 비강철 인큐베이터에서 배양한다.

분석기에 넣기 직전, 각 웰에 필요한 경우 분석기 기질, 억제제 또는 약물을 포함한 미리 가열된 미토콘드리아 분석 버퍼 450마이크로리터를 추가하여 총 부피를 500마이크로리터로 만듭니다. 이제 플레이트는 Seahorse 바이오분석기의 보정된 센서 카트리지를 사용해 분석할 준비가 완료되었습니다. 먼저, 전자 전달계와 산화적 인산화 사이의 결합 정도를 조사하기 위해 결합 분석법을 수행합니다.

결합 분석은 미토콘드리아 기능과 기능 장애를 구분하는 데 도움을 줍니다. 이 미토콘드리아 전자 전달 시스템의 다이어그램에서는 복합체 1, 3, 5가지 특정 억제제와 피루브산, 말레이트 등 다양한 기질의 노드와 함께 전자를 시스템에 기증합니다. 이 시각화는 분석이 어떻게 작동하는지, 다양한 기질 및 억제제의 역할을 이해하는 데 유용합니다.

먼저 5마이크로몰과 10마이크로몰라 두 가지 농도의 디토닌을 분석하며, 이들이 형질막을 통한 전자 전달을 촉진하고 결합 분석을 가능하게 하는 효과를 평가합니다. 이 검사에서는 호흡 결합 수준을 숙시네이트를 기질로, 로테논을 복합 억제제로 사용하여 순차적으로 산소 소비량을 측정하여 평가하였다. ADP, 올리고마이신, FCCP, 항마이신 A를 순차적으로 주입하였고, 각 주사 후 OCR 측정값을 기록하였습니다.

왼쪽 패널은 과도 미세 챔버 내 산소 장력 운동 에너지를 나타내는 선 그래프를 보여줍니다. 일반적으로 이 값은 센서의 동적 범위 내에서 검출되도록 100에서 200 mm 수은간 사이로 유지되어야 합니다. 이 데이터 세트는 Agilent Wave 소프트웨어의 포인트 투 포인트 모드를 사용하여 생성되었으며, 측정 기간 동안 OCR을 일련의 속도로 표시하여 동적 변화를 시각화할 수 있게 했습니다. 특히 10 micromolar 디토닌이 5 micromor 대신 육신산 수송을 증가시켜 미세 챔버 내 산소 장력이 낮아지고 그에 따라 산소 흡수량이 증가했습니다.

이 실험에서 얻은 데이터를 그래프로 정리한 결과, 복합체 2에서 4 복합체에 의한 기저호흡은 10마이크로몰라 디토닌에서 5마이크로몰라보다 유의미하게 높았으며, 이는 높은 농도에서 투과화된 원형질막을 가로지르는 숙신산 수송이 더 효율적임을 시사했다. 이 관찰을 바탕으로, 그리고 10 마이크로몰라 디토닌이 최적의 투과성을 제공한다는 점을 고려하여, 우리는 기저 호흡을 낮추기 위해 세포 수를 우물당 20,000개로 줄였습니다. 이 조정은 약물이나 기질에 의한 호흡 증진이 시스템의 동적 감지 범위 내에 머무르도록 보장했습니다.

디토닌 농도와 세포 수가 최적화된 후, 다음 결합 검사를 통해 무스카린 작용제와 길항제가 미토콘드리아 호흡에 미치는 영향을 평가하였습니다. 이 실험에서 중요한 발견 중 하나는 디토닌 미처리 세포에서 숙시산 유도 복합체 2에서 4에 의해 매개되는 기저호흡과 State-3 및 State-3u 호흡이 유의미하게 감소했다는 점입니다. 이는 석신산이 비투과성 조건에서 세포로 운반되지 않았음을 나타냅니다.

여러 독립 실험 데이터를 그래프로 정리한 결과, 무스카린 길항제 아트로핀은 신경모세포종 세포 내 2에서 4 복합체에 의해 매개되는 기저 호흡을 유의미하게 감소시켰으며, 높은 호흡량을 유지한 무스카린 작용제 아세틸콜린에 비해 효과가 나타났습니다. 더불어, State-3와 State-3u 호흡은 비투과성 세포에서 투과성 세포보다 유의하게 낮아, 디토닌이 미토콘드리아 기능을 저해하지 않으면서 원질막을 선택적으로 투과시키는 데 효과적임을 강조했다. 전자 흐름 분석법은 미토콘드리아 전자 전달 사슬로의 전자가 순차적으로 전달되는 과정을 평가하여 미토콘드리아 기능 장애 또는 조절의 메커니즘을 규명하는 데 도움을 줍니다.

분석 초기 단계에서 세포는 피루베이트, 말레이트, FCCP로 처리되었으며, 이는 1번부터 4번 복합체에 의해 유도되는 높은 수준의 분리 호흡을 유도하였습니다. 이후 로테논 첨가는 복합체 1을 억제하여 기저호흡을 감소시키고 복합체 2에서 4 복합체 활성을 분리시켰다. 약물 치료 조건과 대조군 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았으나, 비투과성 세포에서 석시산 유도 State-3u 호흡이 유의하게 낮아져 디지토닌이 석신 세포 내 침입을 가능하게 하는 중요한 역할을 한다는 중요한 관찰 중 하나가 관찰되었습니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 미토콘드리아 생체에너지학을 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 전체 세포 구조의 생리학적 관련성과 분리된 미토콘드리아 분석의 정밀도를 결합하여, 기질과 억제제의 통제된 전달을 가능하게 하면서 소기관의 무결성을 유지할 수 있게 합니다. 디토닌 농도와 세포 밀도를 최적화함으로써 연구자들은 정확하고 재현 가능한 측정을 달성할 수 있습니다.

이러한 유연한 접근법은 수용체 매개 미토콘드리아 기능 조절을 탐구하는 데 이상적이며, 질병 연구와 신약 개발에 강력한 플랫폼을 제공합니다.