Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

우리의 연구는 에피제네틱 조절이 유전자 발현을 형성하는 방식, 특히 다양한 생물학적 조건에서 염색질 접근성이 어떻게 유전자 활동을 조절하는지에 초점을 맞추고 있습니다. C.elegans의 ATAC-seq는 보호 외피로 인해 제한됩니다. 우리의 프로토콜은 이러한 장벽을 극복하여 신뢰할 수 있는 염색질 접근성 분석을 가능하게 합니다.

시작하기 위해, L1 벌레의 동기화된 개체군을 얻고 20도 섭씨에서 26시간 동안 자라게 합니다. 현미경으로 대부분의 벌레가 L4 단계에 있는지 확인합니다. M9 버퍼로 플레이트에서 모든 벌레를 회수하고 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

벌레를 5번 세 번째로 1밀리리터의 무균 물로 씻고 중력으로 가라앉게 합니다. 다음으로, 벌레가 들어있는 튜브를 30분 동안 25도 섭씨 인큐베이터로 옮겨 장내 음식 잔유물을 제거합니다. 그런 다음 50 마이크로리터의 벌레 펠렛을 새 튜브에 넣습니다.

벌레를 용해시키기 위해 200 마이크로리터의 신선한 SDS-DTT 버퍼를 추가하고 정확히 5분 동안 튜브 회전기에서 혼합합니다. 다음으로, 찬 계란 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 피코퓨지에서 상청을 제거하고 여섯 번 반복합니다.

그 후, 신선하게 준비된 프로나제 80 마이크로리터를 추가합니다. 200 마이크로리터 피펫과 필터가 장착된 팁을 사용하여 벌레 프로나제 혼합물을 70번 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양합니다. L15 10% 태아 우 혈청 배지 800 마이크로리터를 추가하고 4도 섭씨에서 500G로 5분 동안 원심분리합니다.

상청을 제거한 후, 이전에 설명된 대로 L15 10% 태아 우 혈청 배지 1밀리리터를 추가하고 원심분리합니다. 펠렛이 세 번 씻겨지면 상청을 제거하고 L15 10% 태아 우 혈청 배지 900 마이크로리터로 펠렛을 재현합니다. 그런 다음 20 마이크로미터 필터를 사용하여 현탁액을 여과합니다.

4도 섭씨에서 500G로 5분 동안 여과된 세포 현탁액을 원심분리합니다. 그런 다음 상청을 제거하고 약 50 마이크로리터를 남깁니다. 신선하게 준비된 용해 버퍼 45 마이크로리터를 추가하고 샘플을 주의 깊게 재현합니다.

그런 다음 샘플을 혼합하지 않고 50 마이크로리터의 워시 버퍼를 주의 깊게 추가합니다. 4도 섭씨에서 500G로 5분 동안 원심분리합니다. 상청을 제거하고 얼음 위에 샘플을 유지합니다.

원심분리하는 동안 샘플당 TN5 믹스를 준비하여 25 마이크로리터의 TN5 버퍼, 24.8 마이크로리터의 핵산효소 없는 물, 0.2 마이크로리터의 TN5 효소를 결합합니다. 원심분리 후 상청을 제거하고 핵을 얼음 위에 유지합니다. 핵 펠렛에 TN5 믹스 50 마이크로리터를 추가합니다.

그런 다음 7번 위아래로 흡입하여 혼합합니다. 열 블록에서 37도 섭씨에서 30분 동안 배양하고 매 10분마다 부드럽게 튜브를 두드립니다. TN5 배양 후, PB 버퍼 300 마이크로리터를 추가하고 최대 속도로 25초 동안 보르텍스로 혼합합니다.

튜브의 전체 부피를 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 최대 속도로 1분 동안 실온에서 원심분리합니다. 스핀 컬럼에 750 마이크로리터의 PE 버퍼를 추가하고 다시 원심분리합니다.

그런 다음 수집 튜브와 함께 상청을 버립니다. 빈 스핀 후, 컬럼을 새 라벨이 붙은 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 37도 섭씨에서 컬럼 중앙에 EB 버퍼 10 마이크로리터를 넣습니다.