RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부
April 17th, 2026
이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.
저희 연구는 주로 만성 간 질환 맥락에서 간세포 관련 병태생리를 조사합니다. 이 프로토콜은 간 조직 절편에서 세포 분리와 RNA 추출을 가능하게 합니다. FFPE(파라포름알데히드 고정 프로토콜 보존 및 반복 방식)와 달리, 정밀한 마이크로 논의와 고품질 샘플을 통해 후속 OMI 분석을 가능하게 합니다.
펜멤브레인 슬라이드를 자외선에 노출시키려면 4분 30분을 사용하세요. 폴리 L 라이신 0.1밀리그램을 밀리리터당 0.1밀리그램으로 코팅하고 자연 건조시키세요. 각 슬라이드의 가장자리는 중성 장착 매체로 밀봉하세요.
RNase 제염제를 사용해 냉동체의 모든 접근 가능한 표면과 모든 도구를 닦아내세요. 75% 에탄올을 사용해요. 붓과 도구를 꼼꼼히 청소하세요.
이제 냉동 온도를 영하 20도로 설정하고 안정될 때까지 기다려. 영하 80도 저장 상태에서 간 샘플을 채취해. 샘플을 최소 15분간 냉동 보존 챔버에 넣어 평형을 맞춥니다.
시료 단계에 두께 2에서 3밀리미터 두께의 OCT 화합물을 바르세요. 그 후 시료 단계를 빠른 빈 선반이나 냉동 저장실 안에 놓아 화합물 층을 미리 고화시킵니다. 소량의 OCT 화합물을 미리 굳어진 층에 바른 후, 평형화된 조직 블록을 수평으로 화합물 위에 놓고 10초에서 15초간 고정합니다.
그 다음 조직 블록이 부착된 채 시료 단계를 냉동 시료 머리에 장착합니다. 이제 블레이드를 클램핑 플레이트와 크라이오스탯 한쪽 뒷판 사이에 조심스럽게 넣으세요. 클램프 레버를 고정해 칼날을 고정하세요.
크라이오스탯 두께 설정을 10마이크로미터로 조정하세요. 조직을 여러 조각으로 잘라서 냉동 조절기 내부의 사전 처리된 펜멤브레인 슬라이드에 직접 부착하고, 영하 20도 섭씨에서 유지합니다. 슬라이드를 실온에서 20분간 해동하세요.
슬라이드를 RN ACE Free PBS로 세 번 세탁하면, 각 세척마다 4회 10초씩 하세요. 조직 절편에 여과한 마이어스 헤마톡실린 용액을 5초에서 10초 동안 첨가합니다. 그 후 슬라이드를 리보뉴클레아제 프리 물로 세 번 세척해 각 세척마다 10초간 헤마톡실린의 잔류를 제거합니다.
현미경으로 염색 품질을 평가하세요. 흡수지로 슬라이드를 닦아서 완전히 자연 건조시키세요. 실험실 작업대 표면을 RNase 오염 제거제로 닦으세요.
컨트롤러를 켜고 현미경이 초기화를 완료할 수 있도록 하세요. 키를 꺼진 위치에서 켜는 위치로 시계 방향으로 돌려 레이저 시스템을 작동시킵니다. 컴퓨터를 켜고 레이저 캡처 마이크로 해부 소프트웨어를 실행하세요.
그 다음 초기화가 완료될 때까지 기다리세요. 이제 멸균된 0.2밀리리터 PCR 튜브를 채취 장치에 삽입하세요. 피펫을 사용해 PCR 튜브 캡에 프로테아제 K 소화 완충제 10마이크로리터를 추가합니다.
수집 장치를 현미경 표본 홀더에 장착하세요. 잔돈 수집기 장치 창에서. 기준점 조정을 선택하고, 카메라 초점을 조정해 기준점을 선명하게 보이게 한 뒤, 필요하다면 화살표 컨트롤로 중앙 중앙에 맞추세요.
조직 단편을 아래쪽이 향하고 라벨 위치가 오른쪽에 있는 상태로 시체 홀더에 넣습니다. 10배 대물렌즈를 선택하고 특정 병리학적 특징이 있는 관심 영역을 식별합니다. 레이저 메뉴로 이동하세요.
보정을 클릭하고 예 선택을 한 후 보정을 완료하세요. 레이저 제어판에서 레이저 출력을 50, 조리개를 5, 속도를 9로 설정하세요. 그 다음 그래픽 툴바를 사용해 대상 영역 주위에 원을 그리세요.
단일 모양을 선택하고 시작 컷 버튼을 눌러 레이저 캡처 미세 해부를 수행하고, 채취 장치를 위치시켜 해부된 조직을 수집합니다. 문서, 이미지를 캡처하려면 파일을 선택한 후 원하는 형식으로 전후 이미지를 저장할 수 있습니다. 원하는 셀을 수집한 후에는 언로드를 눌러 콜렉터를 스테이지에서 제거합니다.
캡에 10마이크로리터의 프로테아제 K 소화 완충제가 남아 있는지 확인하고 필요 시 보충하세요. 튜브를 닫고 완전히 소용돌이 모양으로 돌리세요. 그 후 튜브를 원심분리기에서 잠시 돌립니다.
RNA 추출 전까지 튜브를 영하 80도에 보관하세요. 펜 슬라이드의 헤마톡실린 염색된 간 절편은 레이저 캡처 미세해리 전후 현미경으로 시각화되었습니다. 미세 소포성 지방증을 보이는 관심 영역은 A PCR 튜브의 캡에 정밀하게 수집되었습니다.
세포 형태를 온전하게 보존하는 것. 약 1000개 및 2000개의 레이저 캡처 미세해리 분리 세포에서 추출한 총 리보핵산은 각각 110.7나노그램과 213.3나노그램을 생산했습니다. 모든 샘플은 1.9에서 2.1 사이에서 260 x 280 나노미터 비율의 높은 순도를 보였다.
젤 전기영동은 28 s 및 18 s 리보솜 리보 핵산 띠를 뚜렷하게 드러냈습니다. 1000개 세포에서 리보핵산의 바이오분석기 프로필을 분석합니다. 리보핵산 무결성 수치는 6.7을 얻었습니다.
하우스키핑 유전자 베타 액틴에 대한 Q-R-T-P-C-R은 17에서 19 사이의 주기 임계값을 제공했습니다. 총 리보핵산 50나노그램으로 구성된 시퀀싱 라이브러리의 바이오분석기 평가 결과, 300에서 500염기쌍 사이의 특징적인 피크가 나타났습니다. 이 라이브러리들의 RNA 시퀀싱은 Q 20과 Q 30 점수 모두 90%를 초과하는 고품질 데이터를 제공했으며, 복제 전반에 걸쳐 낮은 오류율을 보였습니다.
중요한 고려사항은 가공 중단, 빠른 염색, 직선 상태를 통한 항분해 방지입니다. 이 절차를 순서로 정렬하면 실시간 PCR 및 단편화 최적화 라이브러리 키와 시퀀싱에 사용할 수 있습니다. 간 샘플에서 확립됨.
이 프로토콜은 간세포 하위 그룹 프로파일링을 가능하게 하며 병리학 중심 간학 연구를 지원합니다.
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Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
