마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 채취하는 프로토콜
2026년 4월 3일
여기서는 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적 소화를 통해 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포기체 y와 같은 후속 응용과 호환됩니다.
이 프로토콜은 주로 온전한 마우스 각막에서 고품질 단일 세포를 얻는 방법을 도입합니다. 저희 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 단일 세포로, 두껍고 두께가 풍부한 단일 세포와 유동 직경 같은 후속 응용에 적합합니다. 먼저, 6주에서 8주 된 안락사 암컷 C57BL6 쥐를 멸균 해부 테이블 위에 올려놓습니다.
PBS로 감긴 눈꺼풀을 헹구고, 안과 가위로 안구 뒤쪽 극을 따라 절개를 하고, 분리된 눈을 얼음 보완 호르몬 상피 배지가 담긴 페트리 접시에 조심스럽게 넣습니다. 1XPBS와 5% 페니실린 스트렙토마이신 보충제로 안구를 세 번 헹구고, 안과 가위와 겸자를 사용해 후극에서 각막 변두막 쪽으로 절개를 합니다. 각막을 강낭과 결막에서 가장자리를 따라 부드럽게 분리한 후 두 쌍의 겸자를 사용해 수정체와 홍채를 완전히 제거합니다.
각막 조직을 PBS로 세 번 세척한 후, 깨끗한 조직을 새 튜브로 옮기세요. 콜라겐제 A 용액 1밀리리터당 5밀리그램씩 1밀리리터를 추가하고, 안안용 가위로 조직을 약 0.5 x 0.5밀리미터 크기의 조각으로 잘게 만듭니다. 각막 조각이 담긴 튜브를 콜라겐제 A 용액과 함께 세포 배양 인큐베이터에서 37도 섭씨에서 1시간 동안 배양합니다.
소화 과정 동안 10분마다 조직을 점검하세요. 큰 조직 조각이 남지 않으면 300G에서 실온에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 조심스럽게 흡인합니다. 다음으로 펠릿을 0.25% 트립신 EDTA 용액 200마이크로리터에 재현탁합니다.
튜브를 37도에 맞춘 세포 배양 인큐베이터에 10분간 넣어 남은 조직 조각을 소화합니다. 마지막으로, 넓은 보어 팁이 장착된 P1000 피펫을 사용해 혼합물을 부드럽게 분쇄하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 앞서 보인 것처럼 세포 현탁을 원심분리하고, 0.04%BSA가 포함된 PBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
헤모사이토미터를 이용해 분리된 각막 세포를 세어보니, 8개의 각막에서 총 1.05 곱하기 10의 5의 제곱 세포가 얻어졌으며, 평균 세포 생존율은 94.6%, 단일 세포 비율은 96.3%를 초과하여 현탁 적용 적합성을 확인했습니다. 면역형광 분석 결과, 세포 현탁액은 83.5%의 판-CK 양성 상피세포, 13.5%의 각막 양성 기질 세포, 그리고 약 3%의 양성 세포로 구성되어 있음을 확인하였습니다. 단일 세포 현탁액에서 추출된 RNA는 약 8.8의 높은 RNA 무결 수와 28S x 18S 리보솜 RNA 비율 약 2.15를 보여 우수한 RNA 품질을 확인시켰습니다.
단일 세포를 얻은 후에는 각막 세포 기능과 표면 표식 탐색을 특성화할 수 있습니다. 이 분야는 세포 간 상호작용 연구입니다. 이 방법의 도전 과제는 각막을 다른 조직과 사실상 분리하는 것입니다.
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개요
본 논문은 마우스 각막 전체에서 고품질의 단일 세포 현탁액을 분리하기 위한 강력한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 정밀한 조직 박리와 순차적인 효소 소화를 결합하여, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 및 유세포 분석과 같은 후속 응용 분석에 적합한 생존 가능한 단일 세포를 준비할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 높은 세포 수와 우수한 생존율을 제공하며 RNA 무결성을 보존하여, 각막의 세포 이질성에 대한 상세한 분석을 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 안과학
- 세포 생물학
- 단일 세포 분석
배경
- 각막은 눈의 가장 바깥층으로, 시력과 안구 표면의 항상성 유지에 필수적입니다.
- 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 위해서는 고품질의 단일 세포 현탁액이 필요합니다.
- 각막 조직은 밀도가 높고 복잡하여 세포 해리가 어렵습니다.
- 기존 프로토콜은 세포 생존율이 낮거나 RNA 품질이 좋지 않은 경우가 많습니다.
연구 목적
- 손상되지 않은 마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 생성하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 수립한다.
- 후속 응용 분석을 위해 높은 세포 생존율과 RNA 무결성을 확보한다.
- 주요 각막 세포 유형의 정확한 식별 및 정량화를 가능하게 한다.
사용된 방법
- 안락사시킨 C57BL6 마우스로부터 각막 적출.
- collagenase A와 trypsin-EDTA를 이용한 순차적 효소 소화.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 기계적 세절 및 부드러운 trituration.
- trypan blue 염색 및 hemocytometer 계수를 통한 세포 생존율 평가.
- Pancytokeratin (상피 세포) 및 Keratocan (기질 세포)에 대한 면역형광 염색.
- bioanalyzer를 이용한 RNA 무결성 분석.
주요 결과
- 8개의 각막에서 약 1.05 × 105개의 세포를 얻었습니다.
- 높은 세포 생존율(94.6%)과 단일 세포 비율(96.3%)을 확인하였습니다.
- 세포 구성: pan-CK 양성 상피 세포 83.5%, keratocan 양성 기질 세포 13.5%, 두 마커 모두 음성인 세포 ~3%.
- RNA 무결성 지수(RIN) ~8.8 및 28S/18S rRNA 비율 ~2.15로, 우수한 RNA 품질을 나타냈습니다.
결론
- 본 프로토콜은 마우스 각막으로부터 고품질의 단일 세포 현탁액을 안정적으로 생성합니다.
- 준비된 세포는 scRNA-seq를 포함한 까다로운 다운스트림 응용 분석에 적합합니다.
- 이 방법은 각막 세포의 기능 및 세포 간 상호작용에 관한 세밀한 연구를 용이하게 합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
마우스 각막에서 고품질의 단일 세포 현탁액을 얻는 것은 발견 단계의 안과 연구를 진전시키고 고해상도 세포 프로파일링을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 본 프로토콜은 밀도가 높은 안구 조직으로부터 RNA가 온전하고 생존 가능한 단일 세포를 준비하는 과정의 결정적인 병목 현상을 해결하며, 이는 후속 단일 세포 분석의 신뢰도에 직접적인 영향을 미칩니다. 견고한 세포 준비 과정은 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높이며, 발견 단계와 전임상 파이프라인 간의 중개 연속성을 지원합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 단일 세포 해상도로 각막 세포의 이질성을 분석할 수 있습니다.
- 세포 생존력과 RNA 무결성을 유지하여 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 정확한 세포 유형 식별을 통해 메커니즘적 리스크 감소를 용이하게 합니다.
- 초기 단계의 안과 타겟 선정에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 어세이 개발을 위해 표준화된 고생존율 단일 세포 현탁액을 제공합니다.
- 후속 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 재현성과 정량적 결과물을 보장합니다.
- 확장 가능한 스크리닝 워크플로우를 위해 검증된 생물학적 재료를 준비합니다.
- 뚜렷한 각막 세포군에 대한 화합물 효과의 신뢰할 수 있는 평가를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 천연 각막 세포의 다양성을 보존함으로써 질환 관련 모델과의 일관성을 유지합니다.
- 번역 바이오마커의 발견 및 검증을 위해 RNA 품질을 유지합니다.
- 발견 단계부터 전임상 단계까지 데이터의 연속성을 보장하여 리스크가 조정된 진전 결정 프로세스를 지원합니다.
- 전임상 안과 연구에서 생물학적 모호성을 줄여줍니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 프로토콜은 초기 발견 단계와 전임상 연구의 접점을 통합하여, 조직 해리부터 단일 세포 분석 및 하위 기능 연구까지의 원활한 전환을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 고충실도 단일 세포 프로파일링을 가능하게 하여 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 분석 준비 및 화합물 스크리닝을 위해 재현 가능하고 정량적인 단일 세포 현탁액을 제공합니다.
- 분석: 비교 분석을 위해 견고한 세포 생존율, 세포 유형 정량화 및 RNA 무결성 지표를 제공합니다.
- 중개 연구: 바이오마커 정렬 및 전임상 검증을 위해 세포 다양성과 RNA 품질을 보존합니다.
- 기업 내 재사용: 안과 연구 프로그램 전반에 걸쳐 적용 가능한 표준화된 프로토콜을 수립합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 타겟 검증 시 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호함을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화되고 재현 가능하며 확장 가능한 단일 세포 준비물을 제공합니다.
- 전략적 가치: 정보에 기반한 진행 여부(go/no-go) 결정을 가능하게 하며 안과 R&D의 자본 효율성을 높입니다.
- 포트폴리오 영향: 위험 조정 우선순위 설정 및 발견 단계 자산의 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 안구 조직 박리 및 효소 소화 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 세포 생존율 분석, 면역형광 염색 및 RNA 무결성 분석 장비의 사용이 가능해야 합니다.
- 재현성과 데이터 비교 가능성을 위해 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 프로토콜 최적화를 통해 다른 조밀한 조직 유형에도 적용 가능합니다.
- 오염을 방지하고 샘플 순도를 보장하기 위해 조직 분리의 정밀함이 매우 중요합니다.
