중화성 항체 역가 측정을 위한 형 간염 E 바이러스 형광 감소 중화 검사

형광 감소 기반 중화검사의 주요 목적은 백신 후보와 HEV에 대한 항체의 중화 가능성을 정량화하는 것입니다. HEV의 알려진 세포병리적 특성은 PRND 검사를 제한합니다. 이 프로토콜은 면역 기반 PRND를 훈련하여 감염된 세포를 시각화하고 나중에는 내 세포를 관찰하는 데 중점을 둡니다. 우선, 새로 분리된 HuH-7 세포를 세는 것입니다.

그 다음 현미경용 유리 커버 슬립을 12웰 플레이트에 넣고, 1밀리리터 완전 DMEM에 10% FBS를 보충하여 웰당 0.20만 세포를 시딩합니다. 세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 정제된 g1-HEV 유전체 4개의 제곱곱에 1.8 곱하기 10을 포함한 혈청 없는 500 마이크로리터 배지를 시드 세포에 추가합니다.

37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 배양하세요. 500마이크로리터 DPBS를 사용해 세포를 세 번 세척하세요. 2% FBS를 보충한 DMEM 2밀리리터를 웰에 추가하세요.

세포를 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 72시간 배양합니다. 세포를 500마이크로리터 DPBS로 세 번 세척하고, 각 세척 사이에 실온에서 5분간 배양합니다. 세포에 4% 파라포름알데히드 500마이크로리터를 첨가하고 실온에서 20분간 배큐합니다.

그 다음, 앞서 보인 DPBS로 세포를 세척합니다. 최종 세척 후에는 실온에서 DPBS에서 30분간 배양하세요. DPBS에 5%의 일반 염소 혈청, 0.5%의 소 혈청 알부민, 0.3%의 Triton X100이 포함된 차단액 250마이크로리터를 추가하세요.

셰이커에서 실온에서 1시간 동안 부양하세요. 차단액을 제거하고 500마이크로리터 DPBS로 한 번 세척하세요. 그 다음 1차 항체 용액 250마이크로리터를 1:500 희석 비율로 첨가합니다.

세포를 4도 섭씨에서 하룻밤 배양하세요. 다음 날, 앞서 보인 대로 세포를 세 번 DPBS로 세척하세요. 1:1,000 희석된 2차 항체 100마이크로리터를 첨가하고, 부식성 챔버에서 실온에서 1시간 배양합니다.

앞서 보여준 세척 인큐베이트 사이클을 수행하세요. DAPI가 포함된 10마이크로리터 안티페이드 시약을 유리 슬라이드에 추가하세요. 커버 슬립을 시약을 향하게 하여 기포를 피하세요.

커버 슬립을 네일 폴리시로 밀봉해 공초점 현미경 시각화를 위해 보존하세요. 갓 분리된 HuH-7 세포를 세어보세요. 그 다음 현미경용 유리 커버 슬립을 12웰 플레이트에 넣고, 웰당 1밀리리터 완전 DMEM에 20만 개의 세포를 시딩합니다.

다음 날, 혈청 무첨가 배지에서 항-ORF2 및 토끼 면역글로불린 G 항체를 10배 희석하고, 시작 항체 농도는 25마이크로그램/밀리리터, 최종 희석은 10의 마이너스 5제곱까지 준비합니다. 희석의 최종 부피는 100마이크로리터여야 합니다. 그 다음, 각 항체 희석에 정제된 g1-HEV 유전체 4개의 제곱에 1.8 곱하기 10을 더합니다.

항체 바이러스 혼합물을 37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 배양하세요. 세포를 500마이크로리터의 DPBS로 세척하세요. 항체 바이러스 혼합물을 세포에 첨가합니다.

37도 섭씨에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 배양하세요. 세포를 500마이크로리터 완충제로 세척하세요. 2% FBS가 포함된 DMEM을 추가한 후, 37도 섭씨에 5% 이산화탄소를 넣은 상태로 72시간 배양합니다.

앞서 보여준 면역형광 염색을 위해 세포를 처리합니다. 형광 이미지를 획득한 후 ImageJ 소프트웨어를 엽니다. 파일을 선택하고 이미지를 열어.

그 다음 Image, Type을 선택한 후 8비트를 클릭해 RGB 이미지를 8비트 형식으로 변환하세요. 임계값을 조정하려면 Image를 선택하고 Adjust를 선택한 다음, Threshold를 설정하여 낮은 레벨을 40, 상위 레벨을 255로 설정하세요. 분석(Analyze)을 선택하고, 입자 분석(Analyze)을 선택하며, 결과 표시(Display results), 결과 제거(Clear results), 요약(summarize), 가장자리 제외(exclude), 관심 영역 합성(Composite of Interest) 등을 활성화하세요.

그 다음 확인을 눌러 형광 점 수를 확인하세요. 제공된 공식을 사용하여 중화율 비율과 NT50을 Log10 NT50의 안티로그 값으로 계산합니다. 모든 필드의 평균과 표준편차를 보여주는 그래프를 그립니다.

감염된 세포에서 모의 감염 세포에 비해 g1-HEV 리보핵산의 유의미한 수준이 검출되었습니다. 항ORF2 항체를 이용한 면역형광 분석법에서 감염된 HuH-7 세포에서 ORF2 발현이 확인되었습니다. 항-ORF2 항체의 50% 중화 역가는 2.1 곱하기 10의 3제곱으로 추정되었다.

대표적인 이미지는 형광 감소 중화 검사에서 모의 감염 및 g1-HEV 감염된 HuH-7 세포의 출현을 보여줍니다. 이 프로토콜을 통해 연구자들은 항HEV 항체의 중화 가능성을 연구하고 50% 중화 역가를 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜의 핵심 단계는 감염성 E 간염 바이러스의 분리와 적절한 세포 염색 및 고해상도 이미지 획득입니다.

RT-qPCR과 ELISA와 같은 대체 방법도 중화 역가를 측정하는 데 사용될 수 있으나, 몇 가지 한계가 있습니다.