초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

우리 연구는 격절 접합 단백질의 발생 비차단 기능을 조사하며, 구조와 생물학적 역할에 관여하는 새로운 구성 요소를 식별하고 특성화하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 초파리 배아의 외배엽상피에서 주름진 격격 접합부의 조직과 차단 기능을 특성화하기 위한 것입니다. 우선, 적절한 유전자형의 건강한 수컷과 암컷 초파리를 교배하여 신선한 사과 주스 접시에 효모 페이스트를 바른 배아 수집 우리에 넣습니다.

성체들이 사과 주스 접시 위에 수정란을 낳도록 허용하세요. 난자 채취 케이지에서 플레이트를 꺼내 25도에서 13시간에서 16시간 동안 배아를 숙성시켜 16단계에 도달합니다. 그 후 16단계 배아를 적절한 고정액에 고정시키고 원하는 항체로 면역염색을 수행합니다.

최상의 결과를 위해서는 40배 오일 이머 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 배아를 촬영하세요. 관심 있는 배아에 초점을 맞춘 후, 픽셀이 과포화되지 않도록 강한 형광 신호를 얻도록 레이저 세기와 게인을 설정하세요. 중장 형태학을 사용하여 밸런서 암호화된 녹색 형광 단백질을 발현하지 않는 16기 배아를 식별합니다.

타액샘이나 후장에 초점을 맞추고, Z-스캔을 가능한 한 큰 내강 직경으로 위치시켜 상피세포의 전체 측막을 시각화합니다. 적절한 라인 평균을 설정하고 최소 20개의 대조군과 20개의 Cora 4 돌연변이 16기 배아에서 편극 조직을 영상화합니다. 부착 접합 마커가 막의 꼭대기-외측 영역에 강하게 국한된 배아의 데이터만 기록하세요.

야생형 16기 배아에서는 부착부 접합부 근처 측막 꼭대기 부위를 따라 주름진 격격 접합 단백질의 풍부도를 평가합니다. 돌연변이체의 외측막 전체에 주름진 격격 접합 마커가 지속적으로 분포한 상태를 기록합니다. 로다민 표지된 10킬로달톤 덱스트란을 0.5몰 인산나트륨에 pH 7.5에서 1밀리그램/밀리리터에 녹여 5밀리몰라 염화칼륨과 함께 신선한 염료 용액을 만듭니다.

바늘 풀러를 사용해 섬유가 포함된 1밀리미터 외경 × 0.5밀리미터 내경의 모세관 튜브를 유리 바늘에 당깁니다. 다음으로, 유리 바늘을 마이크로매니퓰레이터의 바늘 홀더에 넣고, 마이크로매니퓰레이터를 역현미경 옆에 배치합니다. 바늘을 현미경 슬라이드와 최대한 평행하게 맞추고, 슬라이드 옆면과 같은 Z-평면으로 내리세요.

바늘 끝을 현미경 슬라이드 옆면에 부딪혀 부러뜨리세요. 바늘을 슬라이드 높이보다 높이 들어 올린 후 장전을 위해 빼세요. 다음, 가장 작은 피펫 팁을 사용해 모세관 안에 염료를 채웁니다.

채워진 바늘을 바늘 홀더에 다시 장전하세요. 현미경 슬라이드 표면에 있는 10킬로달톤 덱스트란의 흐름을 검사하여 소량의 할로카본 오일 한 방울에 주입하세요. 22 x 22mm 두께의 넘버 커버 슬립을 사용해 사과 주스 접시에 찌든 선을 만듭니다.

대조군과 코라 4 돌연변이 배아를 16단계 또는 17단계에 각각 약 25개 정도 배치하세요. 뒤쪽 끝이 선을 따라 정렬되고, 배면이 위를 향하도록 하세요. 그 다음 22 x 22mm 2번 커버 슬립에 양면 테이프를 붙입니다.

테이프를 배아 라인에 대고 커버 슬립을 가볍게 문지르면 배아를 플레이트에서 양면 테이프로 옮기세요. 다음으로, 현미경 슬라이드에 할로카본 오일 한 방울을 넣고, 모세관 작용을 통해 슬라이드에 덮개 슬립을 부착해 결합을 만듭니다. 커버 슬립을 슬라이드 쪽, 서리가 낀 부분 반대편에 더 가깝게 배치하세요.

배아를 건조제가 든 용기에 3분에서 5분간 건조시키고, 배아를 완전히 할로카본유로 덮으세요. 배아가 들어간 슬라이드를 역현미경에 올려놓고, 배아는 대물에서 반대편을 향해 위를 향하게 합니다. 마이크로매니퓰레이터를 바늘이 배아의 뒤쪽 끝을 최대한 평행하게 각도로 맞추고, 마이크로매니퓰레이터의 Z축을 바늘 끝이 배아의 등쪽-복측 축을 따라 배아의 중간점과 정렬되도록 조정하세요.

다음으로, 단계를 바늘 안으로 빠르게 이동시켜 바늘 끝이 혈구에 들어가도록 하여 배아를 주입합니다. 10-25 또는 50밀리리터 주사기를 사용해 약 0.2에서 0.5 나노리터의 염료를 주입합니다. 바늘을 빠르게 빼고 다음 배아로 옮겨 조료 주입을 하세요.

그 후 배아 위에 추가로 할로카본 오일을 추가로 발라주세요. 배아를 22 x 22mm 크기의 넘버 2 커버 슬립으로 덮어 커버 슬립 사이에 균일한 기름층을 만들고 압박을 방지합니다. 덱스트란 염료 주입 후 형광 화합 현미경 또는 공초점 현미경으로 영상 촬영을 수행합니다.

공초점 현미경에서 배아 깊이의 약 4분의 1 지점을 등-복축을 따라 Z-스택을 확보하여 기관의 내강을 평가합니다. 기관, 침샘, 또는 후장의 내강에서 라벨링된 덱스트란이 축적되어 있는지 검사하세요. 각 배아의 유전자형과 발달 단계, 그리고 라벨링된 덱스트란이 어떤 관 기관에 축적되는지 기록하세요.

perivitelline 공간이 염료로 강하게 염색된 배아는 의도치 않은 주입을 나타낼 수 있으므로 주의하세요. 야생형 배아에서는 13단계에서 외막을 따라 균일하게 국소화되었고, 14단계에서 측막 끝부에 풍부해졌으며, 16단계에는 부착부 접합부의 기저부에 강하게 국소되었습니다. 피질 항체 염색은 16기 야생형 배아에서 Mcr과 유사하게 성숙한 주름 격격 접합부를 정의했습니다.

Cora 4 돌연변이 배아에서 Mcr은 16단계까지 강한 첨단 위치성을 달성하지 못하고 외막을 따라 분포된 상태로 남아 있었습니다. E-카데린 위치는 야생형과 Cora 4 돌연변이 16기 배아에서도 유사하게 나타났다. 로다민 표지된 10킬로달톤 덱스트란을 주입한 야생형 17기 배아에서는 염료가 기관을 둘러싸고 있었으나 내강에는 침투하지 않았습니다.

Cora 4 돌연변이 17기 배아에서는 주입 후 10분 이내에 기관 내강에 염료가 축적되었습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 초파리 배아 조직에서 주름진 격격 접합부의 핵심 또는 부속 구성 요소를 암호화하는지 확신할 수 있게 합니다. 이 기법을 수행할 때 배아 단계(embryo stageaging)는 절대적으로 중요하며, 16단계 배아가 필요합니다.

중격 접합부는 시간이 지남에 따라 성숙하여 16단계에서 완전히 자리 잡습니다. 이 프로토콜은 RNA 간섭선을 이용한 개방형 유전자 스크리닝에서 효과적으로 구현되어 새로운 주름 중격 중격 접합 유전자를 식별할 수 있다고 믿습니다.