Name: 유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 API5 유도 줄기 특성을 밝혀내다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 학습하세요 유방 구상 형성 분석법을 통해 비종양성 유방 상피 세포에서 API5가 유도하는 줄기 특성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 암 줄기세포 유사 표현형을 연구하는 데 활용됩니다.

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1. 조직 배양 플레이트에 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), pHEMA 코팅
<ol>
	<li>1.2 g의 pHEMA(분자량 300,000)를 100 mL 95% 에탄올에 65 °C에서 지속적으로 저어 1.2% pHEMA 용액을 준비합니다( 재료표 참조).</li>
	<li>6웰 플레이트의 웰당 1mL씩 pHEMA를 적용하여 표준 조직 배양 플레이트에 pHEMA를 코팅합니다. pHEMA 용액의 부피는 조직 배양 용기의 크기에 따라 조절할 수 있습니다.</li>
	<li>접시를 멸균 조건에서 40°C 오븐에 건조시키세요.</li>
	<li>플레이트를 15분간 자외선에 노출시킨 후, 둘벡코의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세 차례 세척한 후 유방구체 형성 분석법을 설정합니다.</li>
</ol>
2. 1차 세대 유방구의 시딩
<ol>
	<li>배양 배양 16일차 3D 배양물을 해리하여 얻은 3D 해리 MCF10A 세포(대조군 및 Api5 과발현)를 배양14. 참고: 성장 배양체 구성: 피루베이트 나트륨 없는 고포도당 DMEM에 5% 말 혈청, 10 μg/mL 인슐린, 0.5 μg/mL 하이드로코르티손, 20 ng/mL 재조합 인간 표피 성장인자(EGF), 100 ng/mL 콜레라 독소, 200 단위/mL 페니실린-스트렙토마이신 보충( 재료표 참조).</li>
	<li>사용한 배지를 제거하고, 1mL DPBS로 세포를 세척한 후 0.05% 트립신-EDTA 500 μL 용량을 추가하고, 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 12-15분간 배양하여 모든 세포가 트립신화될 때까지 배양합니다.</li>
	<li>모든 세포가 분리된 후, 2mL의 재현탁액을 넣어 트립신 활성을 중화시키고, 112 × g 에서 실온에서 10분간 세포 부탁액을 돌립니다. 참고: 재현탁 배지 조성: 피루브산나트륨 없는 고포도당 DMEM에 20% 말 혈청과 200 단위/mL 페니실린-스트렙토마이신을 보완함.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1mL의 유방구체 배지에 재현탁합니다. 셀 현탁액을 25G 바늘에 통과시켜 단일 셀 현탁액을 만듭니다. 참고: 유방 배지 조성: DMEM/F12에 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 비타민 A 없는 × B27 보충제 1개, 그리고 200단위/mL 페니실린-스트렙토마이신( 재료표 참조).</li>
	<li>혈구계를 사용해 세포 수를 세고, 우물당 0.2 ×4 세포를 씨앗하는 데 필요한 세포 부유액을 계산합니다. 참고: 유방구의 형성 효율을 정확히 측정하기 위해 낮은 씨앗 밀도를 유지하여 세포 집집의 영향을 최소화할 수 있습니다. 면역블롯을 위해 단백질 용해액을 채취할 때, 세포 밀도를 웰당 최대 2.5 × 105 세포까지 증가시킬 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 세포 현탁 부피를 2mL의 유대구체 배지에 희석한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 씨앗을 심습니다. 각 조건마다 3배로 씨앗 세포를 배치합니다.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 7일간 배양합니다.</li>
	<li>배양 7일 후, 현미경 아래 그라티큘이 장착된 현미경이나 광현미경 아래 사분면 격자를 사용해 각 웰의 50 μm 이상의 유방구의 수를 수동으로 세어보라.</li>
	<li>광학 현미경에 장착된 디지털 카메라를 20배 배율로 유방구를 영상화합니다.</li>
	<li>다음 공식으로 유대권 형성 효율(MFE)을 계산하세요5 
	 <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. 2차 세대 유방구의 씨앗
<ol>
	<li>1세대에 형성된 매머스피어를 15mL 튜브와 원심분리기에서 300 × g에서 10분간 실온에서 수집합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고, 유방구의 펠릿은 남겨두세요.</li>
	<li>펠릿을 DPBS로 세척하세요.</li>
	<li>유방구체 펠릿에 0.05% 트립신-EDTA 200 μL 첨가하고, 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2-3분간 배양합니다. 트립신 용액 내 유방구체를 25G 바늘에 세 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.</li>
	<li>0.5mL의 재현탁액을 첨가하여 트립신 활성을 중화시키고, 112 × g 에서 실온에서 10분간 세포 현탁액을 돌립니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 0.5mL 유방구체 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>혈구계를 사용해 세포 수를 세고, 웰당 0.2 × 10개의4 세포를 씨앗하는 데 필요한 세포 부피를 계산합니다. 참고: 세포 밀도를 낮게 유지하여 자가 갱신 능력을 평가하여 세포 응집의 영향을 최소화하세요.</li>
	<li>필요한 세포 현탁 부피를 2mL의 유대구체 배지에 희석한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 씨앗을 심습니다. 각 조건마다 3배로 씨앗 세포를 배치합니다.</li>
	<li>37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 7일간 배양합니다.</li>
	<li>배양 7일 후, 각 플레이트에 직경 50 μm 이상의 유방구의 개수를 현미경으로 세어보며, 그라티큘이 장착된 장치나 사분면 격자형을 사용합니다.</li>
	<li>광학 현미경에 장착된 디지털 카메라를 20배 배율로 유방구를 영상화합니다.</li>
	<li>다음 공식5를 사용하여 자가 갱신 능력을 계산합니다 
	<img alt="방정식 2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Api5 과발현 시 다능성 마커 변화를 감지하기 위한 서부 블롯
<ol>
	<li>1세대에 형성된 유방구를 15mL 튜브와 원심분리기에서 300 × g에서 실온에서 10 분간 수집 합니다.</li>
	<li>상청액을 흡인하고, 유방구의 펠릿은 남겨두세요.</li>
	<li>펠릿을 DPBS로 세척하세요.</li>
	<li>펠릿을 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 담아 단백질 용해액을 얻고, 표준 프로토콜24에 따라 면역블롯을 수행합니다. 참고: RIPA 완충액 조성: 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% 트라이톤 X-100, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨(SDS), 1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 1 mM 페닐메티설폰닐 플루오라이드(PMSF), 10 mM 플루오라이드 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트 나트륨.</li>
	<li>줄기 마커 - Oct3/4, Nanog, Sox2, Bmi1 및 부하 조절 GAPDH(항체 희 석 관련 재료 표 참조)를 탐침합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 덴시토메트릭 분석을 이용해 단백질 농도를 정량화할 수 있습니다. 서부 블롯 이미지에서 관심 영역을 선택하고 각 레인에 대한 밀도 프로필을 생성합니다.</li>
	<li>각 레인별로 관심 단백질의 GAPDH 밀도와 상대 밀도를 정규화합니다. 각 단백질의 접힘 변화를 계산하세요.</li>
	<li>어떤 플로팅 소프트웨어든 접힘 단백질 수치 변화를 그래프로 표시하세요.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
<li>Ponti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+propagation+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+with+stem%2Fprogenitor+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties.</a> Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).</li>
<li>Kim, R. J., Nam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCT4+expression+enhances+features+of+cancer+stem+cells+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Res%22%5BJournal%5D)">OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer.</a> Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).</li>
<li>Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pluripotency+factor+nanog+promotes+breast+cancer+tumorigenesis+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis.</a> Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).</li>
<li>Leis, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+expression+in+breast+tumours+and+activation+in+breast+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells.</a> Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).</li>
<li>Paranjape, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+self-renewal+and+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+breast+cancer+cells+through+Nanog%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog.</a> BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).</li>
<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
<li>Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+anti-apoptotic+protein+Api5+affects+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis.</a> BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
<li>Jang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+induces+cisplatin+resistance+through+FGFR+signaling+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells.</a> Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 가습 인큐베이터</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 토끼 pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 희석, 4 &deg;C에서 야간 배양</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH 항체</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 희석, 상온에서 1시간 배양</td></tr><tr><td>Anti-Nanog 토끼 mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 희석, 4 &deg;C에서 야간 배양</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 항체 (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 희석, 4 &deg;C에서 야간 배양</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 항체 (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 희석, 4 &deg;C에서 야간 배양</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50x), 비타민 A 제외</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;dH2O에 1 mg/mL 스톡</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's 인산염 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>피부 성장 인자 (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>dH2O에 100 mg/mL 스톡</td></tr><tr><td>절대 에탄올 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디나트륨염 이수화물 (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>고글루코스 DMEM (나트륨 피루브산 제외)</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>말 혈청&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Tris-HCl (pH 8.0)의 pH 조정에 사용</td></tr><tr><td>하이드로코티손&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>에탄올에 1 mg/mL 스톡</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western 화학발광 HRP 기질</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>인슐린&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>1% 결산에 10 mg/mL 스톡</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 현미경</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A 세포</td><td></td><td></td><td>Raymond C. Stevens 교수(Scripps Research Institute, USA)의 선물</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>플로팅 소프트웨어&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>95% 에탄올에 1.2% pHEMA</td></tr><tr><td>염화 나트륨 (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>소듐 플루오라이드 (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 오르토바나데이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 완충액</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 api5 유도 줄기 특성을 밝혀내다

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

비관착 조건에서 유방구체 형성 효율을 평가하기 위해, 프로토콜에 따라 polyHEMA 코팅 판에 대조군 및 Api5 과발현 3D 해리 MCF10A 세포를 시딩하였습니다. Api5 과발현 세포는 대조군에 비해 평균 유방구 형성 효율이 1.58배 증가하는 것을 보였다(그림 1B, C). 이 증가는 Api5의 발현이 높을수록 혈청이 부족한 비부착 조건에서 생존하고 증식하는 줄기세포 유사 전구세포의 비율이 증가하여 클론 유래 구체가 형성됨을 보여줍니다.
주요 유방구는 수집되어 분리된 후 재심어져 2세대 유방구를 형성했습니다. Api5 과발현 세포는 대조군 세포보다 평균 자가갱신 능력이 거의 2.5배 높았습니다(그림 1D,E). 이 결과는 Api5의 과발현이 자가 갱신하는 줄기세포 유사 세포 풀을 증가시켜 연속 통과 과정에...

유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 API5 유도 줄기 특성을 밝혀내다

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 유방암 세포주에서 암 줄기세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 이러한 암 줄기세포를 배양하여 자가 재생을 평가하고 구 형성 효율성을 계산하기 위한 1차 유방구를 생성하여 다양한 시딩 밀도를 비교할 수 있습니다.

1차 유방구의 생성: 세포 효능을 결정하는 기술

인간의 유방 수술 폐기 자료를 처리하는 방법이 설명되어 있습니다. organoids의 형태로 처리 조직은, 무기한 정지 또는 장기 성장 문화에 배치 저장할 수 있습니다. 이 방법은 실험 정상적인 인간 내피 세포 생물학의 심사 및 외인성 섭동의 효과를 수 있습니다.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

시험관 분야 분석법은 암 줄기세포를 식별하는 데 일반적으로 사용됩니다. 여기에서는 단일 분석과 다중 세포 기반 구체 분석을 비교합니다. 더 힘든 단일 세포 기반 분석 또는 메틸셀룰로오스 보충제는 더 정확한 결과를 제공하는 반면, 액체 배지에서 수행되는 다중 세포 기반 분석은 세포 밀도의 영향을 크게 받을 수 있습니다.

다중 및 단일 세포 기반 분야 분석 실험을 사용하여 인간의 난소 암 세포의 줄기 세포 특성의 평가

부유 유방구 분석은 현탁 상태에서 생존하고 마우스에 이식했을 때 향상된 종양 형성을 보여주는 줄기 유사 유방암 세포의 하위 집합을 조사할 수 있습니다.  이 프로토콜은 생체 내 종양 형성의 대용물인 구 형성 능력의 편리한 체외 측정을 제공하는 동시에 줄기 관련 전사 환경의 분석을 용이하게 합니다.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

이 방법론의 목적은 유세포분석및 서양세포분석과 서양계의 기능성 분석및 현상형 특성화를 사용하여, 구형 프로토콜을 사용하여 암 세포주 및 원발성 인간 종양 샘플에서 암 줄기세포(CSC)를 식별하는 것입니다. 얼룩.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

여기서, 우리는 시험관 내 유방동체재생정량분석법의 결과의 이행 및 해석을 설명한다.

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는  확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

학습하세요 유방 구상 형성 분석법을 통해 비종양성 유방 상피 세포에서 API5가 유도하는 줄기 특성을 평가하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 암 줄기세포 유사 표현형을 연구하는 데 활용됩니다.

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