행동 실험을 기반으로 한 제브라피시 유충에서 MPTP 유도 파킨슨 유사 행동 표현형의 표현형 프로파일링

우리는 유생 얼룩말피시에서 운동 및 비운동 파킨슨 표현형을 포괄적으로 프로파일링하기 위한 다중 매개변수 행동 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 파킨슨병 모델링, 약물 선별, 환경 신경독성, 어류 유충을 이용한 연구에 적용됩니다. 우선, 장갑, 실험실 가운, 보호 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.

100x E3 스톡 용액을 1:100 비율로 초순수수와 희석하여 단일 강도 배지를 준비합니다. 이제 성적으로 성숙한 수컷과 암컷 성체 제브라피시를 선택하세요. 분리 가능한 번식 수조를 사용하여 통제된 번식을 수행하세요.

오후 8시에 수컷과 암컷 제브라피시를 번식 수조의 별도 구역에 배치하고, 수컷 2마리와 암컷 3마리 비율로 분리하여 분리합니다. 다음 날 아침 8시에 교미를 위해 칸막이를 제거하세요. 배아를 한 시간 후에 채취하고 깨끗한 시스템용수로 세 번 세척하세요.

배아는 20밀리리터의 신선한 E3 배지가 들어 있는 100밀리미터 페트리 접시에 보관하세요. 그 후 배아를 섭씨 28도에서 14시간의 빛과 10시간의 어둠 주기 아래 배아합니다. 수정 후 하루 만에 목초지 피펫을 사용해 수정되지 않았거나 기형이 있거나 비정상적인 배아를 조심스럽게 제거하세요.

페트리 접시 가장자리에서 배지를 천천히 흡입한 후, 야생형 배아에 영향을 최소화하기 위해 페트리 접시 벽을 따라 신선한 E3 배아 배지를 추가하세요. MPTP 처리군에는 50마이크로몰라 MPTP 용액을 사용하세요. 수정 후 4일 후, 3밀리리터 목초지 피펫을 끝에서 10밀리미터를 잘라내어 넓은 보어를 만듭니다.

오후 6시에 수정된 피펫을 사용해 각 그룹에서 제브라피시 유충을 선택하고, 각 웰당 유충 한 마리를 96웰 플레이트에 옮깁니다. 각 웰을 입체 현미경으로 관찰하여 각 얼룩말피시 유충이 건강해 보이는지 확인해 보세요. 지느러미가 열려 있고 규칙적으로 흔들리고 있으며, 몸이 똑바로 서 있고, 수영 사다리가 팽창되어 있는지 확인하세요.

다음으로, 비디오 트래킹 결과에 오염이 영향을 미치지 않도록 플레이트 하단을 조심스럽게 청소하세요. 그 다음 96웰 플레이트를 제브라 박스 챔버 하단 중앙에 옮깁니다. 비디오 트래킹 소프트웨어에서 양자화 모드를 선택하세요.

수면 및 각성 조절 모니터링을 위해서는 조명 조절을 밤 10시에 꺼고 오전 8시에 켜도록 설정하세요. 소프트웨어 매개변수를 설정하여 탐지 임계값을 40, 버스트를 25, 프리즈를 4, 총 모니터링 시간을 52시간, 그리고 60초로 설정하세요. 8시에 수면 깨어 절차를 시작 PM.To 광운동 반응을 모니터링하고, 수정 후 5일째 유충을 96웰 플레이트에 넣고, 각 웰마다 유충 한 마리씩 넣습니다. 그 다음 빛 전환 프로그램을 0초에서 60초간의 어둠, 이어서 60초에서 120초간의 지속적인 빛으로 설정하세요.

프로토콜을 시작하고 120초 동안 6초마다 운동 매개변수를 수집합니다. 프로토콜을 120초에서 멈추고 데이터 파일을 내보내세요. 그 후 유충을 완전한 어둠 속에 5분간 두어 다음 암흑 스트로브 라이트 검사를 위해 적응시킵니다.

라이트 트랜지션 프로그램을 10헤르츠로 60초 동안 스트로브 라이트를 제공하도록 설정하세요. 주행성을 평가하려면 두 개의 6웰 플레이트를 선택하세요. 각 웰마다 E3 매체 4밀리리터를 채우세요.

수정 후 5일째에 야생형 그룹과 MPTP 처리군에서 제브라피시 유충을 채취하여 각각 6개의 웰 플레이트에 배치합니다. 삼각성 평가 전에 웰 플레이트를 얼룩말 박스에 15분간 넣어 적응을 돕습니다. 그 다음 드로잉 면적 함수를 사용해 각 웰에 내부 원반지름이 절반인 동심원 두 개를 그리고 평가를 시작하세요.

운동 평가를 위해 야생형 그룹과 MPTP 처리된 그룹에서 5일 된 제브라피시 유충을 두 개의 별도 12웰 플레이트에 옮깁니다. 15분간의 적응 후 추적 온라인 분석 모드를 선택하고 자동 영상 추적 시스템을 사용해 5분간 운동 활동을 기록합니다. 놀람 반응 테스트에서는 5일 된 유충을 각각 12웰 크기의 두 플레이트에 각각 유충 1마리와 E3 매체 2밀리리터를 각각 옮깁니다.

접시를 얼룩말 상자에 넣어 5분간 가벼운 적응 시간을 가집니다. ZebraLab 소프트웨어를 실행하고 추적 온라인 분석 모드를 활성화하세요. 빛 트리거 인터페이스를 열고, 아래 세 가지 트리거 방법 중 하나를 선택해 강화 자극을 활성화하세요.

그 다음, 시작 메서드를 세션이 시작될 때로 설정하세요. 전환 일정에서 다크 플래시 리듬을 정의하세요. 프로그램을 21초 후 트리거로 설정한 후, 100%의 빛 강도에서 1밀리초로 전환을 설정하세요.

2에서 2로 전환, 890밀리초, 100% 빛 강도로 전환. 빛 세기 0%에서 3밀리초에서 5밀리초, 빛 강도 0%에서 4밀리초에서 100밀리초 전환. 주기적인 플래싱을 보장하기 위해 전이 반복 목록을 체크한 후 프로토콜을 시작하세요.

밝고 어두운 도전 분석에서는 제브라피시 유충을 24웰 플레이트 두 개에 옮기고, 각 웰마다 유충 1마리와 E3 매체 1밀리리터를 투여합니다. 얼룩말 박스에서 5분간 적응한 후, 추적 분석 온라인 모드를 켜세요. 그 다음 조명 프로그램을 6분간 지속적인 빛과 4분간 완전한 어둠으로 설정하세요.

10분에 행동 기록을 중단하고 데이터를 저장하세요. 조심스럽게 얼룩말 상자에서 플레이트를 떼어내세요. 각 행동 실험 후에는 MPTP 접촉 표면에 새로 준비한 차아염소산나트륨 용액으로 뿌리고 닦아주세요.

MPTP가 포함된 액체 및 고형 폐기물을 수집하여 유해 신경독성 폐기물로 명확히 표시하세요. 오염된 모든 물질은 신선하게 준비된 차아염소산나트륨 용액으로 처리하세요. 처리한 제브라피시 유충은 야생형 그룹에 비해 수면 및 각성 활동 흔적이 나타났습니다.

총 수면 시간도 치료군에서 유의하게 증가했습니다. 치료군에서는 외출 횟수가 유의미하게 감소한 반면, 평균 외출 시간은 증가했습니다. 치료 그룹에서는 각성 활동과 평균 활동이 유의하게 손상되었습니다.

지속적인 조명 하에서 처리된 그룹의 동결과 지수가 유의미하게 증가했습니다. 또한 10헤르츠 스트로브 라이트 자극 하에서도 크게 증가했습니다. 광운동 반응 곡선은 치료군에서 반응성이 감소하는 것으로 나타났습니다.

추적 결과는 치료군에서 운동 및 탐색 행동이 감소함을 나타냈습니다. 총 수영 속도와 평균 수영 속도도 치료군에서 유의미하게 감소했습니다. 고정 이동 시간 비율은 처리된 그룹에서 유의미하게 높았으나, 빠른 이동 시간 비율은 현저히 낮았습니다.

야생형 유충에서 번갈아 나타나는 밝은 빛과 어두운 전환은 뚜렷한 속도 피크를 만들어냈다. 자극 후 수영 거리와 자극 후 최대 속도는 치료군에서 유의하게 감소했습니다. 치료 그룹에서는 움직임 시작 속도 잠복 시점까지의 지연도 유의미하게 지연되었습니다.

주요 과제는 내부 결정 요인을 최소화하면서 개체별 변동성을 고려하여 제브라피시 수준에서 정확하고 재현 가능한 행동 분석을 보장하는 것입니다. 행동 군집화와 표현학적 프로파일링을 통해 미묘한 신경독성 효과를 밝히고 더 깊은 자기적 통찰을 얻을 수 있습니다. 향후 연구들은 이 플랫폼을 위험 승인 약물 스크리닝과 제브라피시 파킨슨병 모델의 약리학적 평가에 적용할 수 있습니다.