중추신경계 병원체 검출을 위한 뇌척수액의 메타게놈 차세대 시퀀싱

이 프로토콜은 뇌척수액 샘플의 메타게놈 차세대 시퀀싱을 위한 연구 기반 프로토콜로, 샘플 내 잠재적 병원체를 탐지할 수 있도록 합니다. 기존 MNGS 프로토콜은 CSF 내 RNA 수율이 낮은 점을 고려하지 않습니다. 이 프로토콜은 샘플 내 낮은 생체량을 고려하기 위해 여러 단계를 최적화합니다.

CSF 샘플을 얼음 위에서 해동하기 위해, 각 샘플당 1밀리리터에 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 옮기고, 16,000G에서 4도 섭씨에서 10분간 원심분리합니다. 그 후 조심스럽게 상상액을 피펫으로 떼어내어 펠릿과 100마이크로리터의 상상액을 남깁니다. 나머지 100마이크로리터의 상청액과 펠릿에 100마이크로리터의 DNA RNA 쉴드를 첨가하고 완전히 혼합합니다.

그 다음 600마이크로리터의 DNA RNA 용해 버퍼를 추가하고 피펫팅으로 혼합하여 용액이 균질해질 때까지 합니다. 제조사의 지침에 따라 DNA 및 RNA 추출 프로토콜을 수행하되, 다음과 같은 중요한 수정사항을 포함하세요. 모든 원심분리 과정을 최대 속도로 1분간 수행하되, 최종 DNA RNA 세척은 3분간 원심분리해야 합니다.

샘플을 희출하기 위해 22마이크로리터의 뉴클레아제 자유 물을 컬럼 매트릭스에 직접 첨가합니다. 그 후 상온에서 3분간 배양합니다. 엘루시안 피펫 후 흐름을 다시 컬럼 매트릭스로 돌려보내고, 최대 속도로 다시 1분간 원심분리한 후 샘플을 새로운 1.5밀리리터 저장관으로 옮깁니다.

RNA 분해와 프라이밍에 필요한 성분을 PCR 튜브 내에서 피펫으로 채취합니다. 튜브를 열순환기에서 가열된 뚜껑을 105도로 맞춘 상태로 부화하세요. 피펫은 분해되고 프라이머된 RNA를 8마이크로리터의 뉴클레아제 프리 워터와 2마이크로리터의 1가닥 합성 효소 혼합물과 혼합합니다.

튜브를 열순환기에서 가열된 뚜껑을 105도로 맞춘 상태로 부화하세요. 그 다음 첫 번째 합성된 가닥 DNA를 48마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물과 섞습니다. 2가닥 합성 반응 완충제 8마이크로리터, 2가닥 합성 효소 혼합물 4마이크로리터.

튜브를 열사이클러에 넣고 16도 섭씨에서 1시간 동안 가열 뚜껑을 끄고 배양하세요. 다음으로, 고상 가역적 고정 자기 비드의 1.8배 비율을 사용하여 자기 비드 정제를 수행합니다. 샘플을 뉴클레아제가 없는 물 53마이크로리터에 용출합니다.

정제된 이중 가닥 CDNA를 포함한 최종 상청액 50마이크로리터를 깨끗한 뉴클레아제 프리 PCR 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 샘플은 영하 20도에서 하룻밤 냉동할 수 있습니다. 샘플이 영하 20도에서 하룻밤 보관된 경우, 다시 시작하기 전에 얼음 위에서 해동하세요.

피펫은 정제된 이중 가닥 CDNA 50마이크로리터와 말단 준비 반응 완충 7마이크로리터, 말단 준비 효소 혼합물 3마이크로리터를 혼합합니다. 샘플을 열순환기에 넣고 20도 섭씨에서 30분, 65도 섭씨에서 30분간 가열 뚜껑을 끄고 배양하세요. 다음으로, 얼음에서 어댑터 리게이션 단계를 수행하는데, 먼저 뉴클레아제가 없는 물에서 어댑터를 1에서 100 희석으로 만듭니다.

최종 준비 반응 혼합물을 30마이크로리터의 리게이션 마스터 믹스, 1마이크로리터의 리게이션 강화제, 2.5마이크로리터의 희석된 어댑터가 포함된 튜브에 피펫팅합니다. 샘플을 열사이클러에 넣고 20도 섭씨에서 15분간 가열된 뚜껑을 끄고 배양합니다. 그 후 즉시 0.9배 비율의 고상 가역적 고정 자기 비드를 이용한 자기 비드 정제로 진행합니다.

그 다음 17마이크로리터의 뉴클레아제 없는 물에 용출합니다. 최종 상원액 15마이크로리터를 깨끗한 뉴클레아제가 없는 PCR 튜브에 옮깁니다. 이제 피펫 정제 어댑터가 CDNA를 사용자 효소 3마이크로리터, Q 5 마스터 믹스 25 마이크로리터, 독특한 바코드 프라이머 10마이크로리터가 포함된 튜브에 연결했습니다.

튜브를 열순환기에 넣고 뚜껑을 105도로 설정한 상태로 보관하고, 제시된 조건에서 배양합니다. 0.8배 자기 비드를 사용하여 최종 자기 비드 정화를 수행합니다. 그 후 샘플을 뉴클레아제 프리 물 23마이크로리터에 용출합니다.

최종 상청액 20마이크로리터를 깨끗한 뉴클레아제가 없는 PCR 튜브에 옮깁니다. DNA 정량 키트와 해당 형광계를 사용하여 샘플 라이브러리의 농도를 정량합니다. 수질 제어 샘플이 다른 샘플에 비해 상당히 낮거나 측정 불가능한 농도를 가지고 있는지 확인하세요.

샘플 라이브러리 크기를 자동 모세관 전기영동기에서 분석하여 평가하세요. 오픈소스 웹 기반 플랫폼인 Chan Zuckerberg ID를 사용하여 병원체 검출을 위한 메타게놈 분석을 수행하세요. Chan Zuckerberg ID에 로그인하고 업로드를 클릭하세요.

분석 유형으로 메타게노믹스를 선택하고 시퀀싱 실행에서 입력된 FASTQ 파일을 선택하세요. 샘플 이름, 샘플 유형, CSF, 뉴클레오타이드 유형 RNA 또는 DNA 등 필요한 샘플 정보를 입력하세요. 처리가 완료되면 샘플이 있는 프로젝트 폴더를 클릭하고 요약 대시보드로 이동하세요.

아래로 스크롤하여 샘플당 리드 수를 확인하세요. 품질 관리 필터링을 통과한 리드 비율과 중복 압축 비율을 검토하여 증폭보다 편향된 PCR을 평가합니다. 프로젝트 폴더 내 외부 DNA 오염을 확인하려면 각 수처리 샘플을 선택하고 배경 모델을 클릭하여 모델을 생성하세요.

분석 중에는 모델을 적용하고 임계값 필터를 사용하여 NTZ 점수를 1보다 높게 설정하여 가능한 오염물질을 제거합니다. 그 후 적절한 통계 소프트웨어를 사용해 데이터를 분석하세요. 모세관 전기영동 및 전기영동 데이터는 CDNA 샘플 라이브러리가 과도하게 분열되어 있으며, 시퀀싱에 적합하지 않은 어댑터 다이머를 포함하고 있음을 보여주었다.

CDNA 라이브러리는 어댑터 다이머 오염이 심하지 않은 상태에서 풀링 및 시서열 분석 준비가 완료되었습니다. CSF 메타게놈 차세대 시퀀싱은 코호트 A와 B에서 다양한 병원체를 검출했으며, 코호트 A 샘플의 73.5%, 코호트 B 샘플의 51.2%에서 최소 한 가지 이상의 병원체가 발견되었습니다. 주요 도전 과제는 소용량 피펫팅과 시간 민감한 B 건조 방식으로, 건조 부족 또는 과도한 건조가 결과를 방해할 수 있기 때문입니다.

이 프로토콜은 병원체 검출 측면에 집중하지만, 이 프로토콜에서 생성된 숙주 RNA 전사체는 추가 후속 분석에도 활용될 수 있습니다. 따라서 향후 연구에서는 이 특정 라이브러리 준비 및 시퀀싱 프로토콜의 성능을 희소 샘플을 대상으로 설계된 신기술들과 비교하여 병원체 검출뿐 아니라 전사체 분석에서도 어떻게 비교되는지 확인하는 것이 중요합니다.