2상 산-용매 방법을 이용한 쥐 배설물에서 단쇄 지방산 추출

이 프로토콜은 저투입 마우스 대변 샘플에서 단쇄 지방산(SCFA)을 추출하여 일상적인 가스 크로마토그래피 기반 분석을 가능하게 합니다. 아세테이트, 프로피온산, 부티레이트를 포함한 SCFA는 식이섬유의 발효를 통해 장내 미생물군에 의해 생성됩니다. 행동, 대사, 생리적 표현형과 연관되어 널리 연구되고 있습니다.

그러나 대변 샘플에서 SCFAs를 정량화하는 것은 여전히 어렵습니다. 이 대사산물은 휘발성이며 종종 낮은 수준에서 존재하며, 복잡한 생물학적 행렬로 측정됩니다. 쥐 연구에서는 각 동물에게서 채취되는 배설물 양도 종종 제한적입니다.

표준 방법은 파생화, 비교적 큰 샘플 부피, 또는 특수 장비가 필요할 수 있습니다. 여기서는 희석된 염산과 에틸 아세테이트를 이용한 2상 산성 용매 추출 워크플로우를 제시하여, 저투입 마우스 대변 샘플에서 SCFAs를 추출하는 방식으로, 일상적인 GC 분석과 호환되는 형식입니다. 그래서 우리는 올바른 배치부터 시작해 나머지 절차를 이어가겠습니다.

다음은 냉동 대변 샘플이 올바르게 라벨링된 샘플 박스입니다. 다음으로 1000마이크로리터 피펫을 255로 설정합니다. 이제 HCl 희석 표지가 나왔습니다.

우리는 계속해서 각 샘플에 HCl을 할당합니다. 이제 핀셋을 쓸 청소 우물에 에탄올을 넣습니다. 우리는 같은 에탄올로 공개를 위한 목욕물을 만듭니다.

이제 우리는 대변 샘플을 채취해 원심분리기 바이알에 넣습니다. 이제 우리는 깨끗한 공을 사용해 각 분변 샘플을 각각의 원심분리기 바이알 안에 분쇄합니다. 샘플을 채취해 최소 10초 또는 완전히 섞일 때까지 소용돌이에 적용합니다.

혼합 샘플을 원심분리기로 가져가 설치합니다. 원심분리기의 적절한 균형을 확보하세요. 원심분리기를 16,000 g 속도로 10분 동안 4도 섭씨에서 설정하세요.

10분이 지나면 샘플을 원심분리기에서 꺼내세요. 샘플에 맞는 새 원심분리기 바이알에 라벨을 다시 붙이세요. 200마이크로리터 피펫을 120으로 설정하세요.

상환액을 조심스럽게 제거하되, 펠릿에 닿지 않도록 주의하세요. 상청액을 각자의 새 바이알로 옮기세요. 알갱이를 버려도 돼.

새 바이알에 같은 양의 에틸 아세테이트를 추가하세요. 이 샘플들을 원심분리기로 가져가세요. 원심분리기를 2,374g로 설정해 20분간 섭씨 4도에서 측정하세요.

20분이 지나면 샘플을 꺼내세요. 샘플에 맞는 새 원심분리기 바이알에 라벨을 다시 붙이세요. 피펫을 120마이크로리터로 다시 설정하세요.

아래쪽 층은 건드리지 않도록 주의하고, 윗층만 제거하세요. 상청액을 올바르게 라벨링된 새 바이알로 옮기세요. 이 샘플들을 샘플 박스로 옮겨 추가 분석할 때까지 보관하세요.

마지막으로, 샘플 박스를 영하 80도 냉동고에 넣으세요. 추출된 SCFA 알리코트는 각각 120마이크로리터로, 가스 크로마토그래피를 이용한 정량화 전에 섭씨 영하 80도 상태로 보관되었습니다. 정량 분석 결과 그림 참조와 같이 주요 대사산인 아세트산, 프로피온산, 부티르산을 포함해 8가지 SCFA가 확인되었습니다.

SCFA 분리 검증을 위해 가스 크로마토그래피 데이터를 회수 및 재현성 검사를 통해 평가하였습니다. 회수는 내부 표준 농도가 알려진 대조군 샘플을 스파이팅하여 평가했으며, 재현성은 며칠 내외 반복 분석으로 검증되었습니다. 요약하자면, 이 프로토콜은 저투입 쥐 대변 샘플에서 SCFA 추출을 위한 워크플로우를 제공합니다.

파생화가 필요 없으며 일상적인 GC 기반 분석과 호환됩니다. 이 방법은 다양한 마우스 모델에서 대변 SCFA 측정을 지원할 수 있습니다.