형광 추적체를 이용한 마우스 치은성 상피 장벽의 기능 평가

이 프로토콜은 치은성 상피 장벽의 무결성을 정량적으로 평가하기 위한 표준화된 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 치은막 기능 장애 질환 연구와 치은돌 장벽 복원 약물 시험에 유용합니다. 우선, 수컷 야생형 C57BL/6J 마우스를 치료하지 않은 대조군, 결찰로 유도된 치주염 그룹, 그리고 포르피로모나스 치뇨병 유발 그룹의 세 그룹으로 나누어 보입니다.

FITC 표지된 덱스트란과 로다민 B 표지된 덱스트란과 같이 겹치지 않는 형광 추적자를 선택하세요. 추적자를 희석하기 위해 FD40과 RD70을 리터당 각각 1g씩 2%카복시메틸셀룰로오스 젤에 혼합합니다. 준비된 혼합물을 얼음 위에 보관하세요.

발가락 꼬집는 반사로 마취 깊이를 확인한 후, 마취 중인 마우스의 구강을 벌려 입 개그를 사용하세요. 준비된 추적자 혼합물 50마이크로리터를 어금니 부위의 음순 치은부 표면에 국소적으로 바릅니다. 혼합물을 30분간 그대로 두었다가 삼켰을 때 다시 발라주세요.

트레이서를 30분 바른 후, 쥐를 종이 위에 눕히고 사지를 테이프로 고정해 동물을 고정합니다. 다음으로, 안락사 시행된 쥐의 구강을 열고 상악골을 분리합니다. 주변 조직을 부드럽게 제거하고 PBS로 표본을 꼼꼼히 헹구세요.

고립된 상악골을 유리 슬라이드 위에 올려놓으세요. 그 다음 양쪽에 모델링 점토를 깔아 표지 슬립을 안정시키고 샘플 위에 고정합니다. 절단된 상악골을 맞춤 설계된 샘플 홀더에 조심스럽게 위치시켜 영상 촬영을 위해 안정적으로 위치시키세요.

25배 수중 물에 담긴 대물렌즈가 장착된 직립형 단일 광자 현미경을 사용했습니다. 상악골 아래에 장착된 지지 부위에 초점을 맞추고 이미지를 촬영하세요. 상악골 내 제2대구치의 구강면에서 관심 있는 부위를 선택하고 즉시 영상 촬영을 시작하세요.

치은기표면에서 100에서 200마이크로미터 깊이까지 1마이크로미터 단계의 Z-스택 이미지를 획득하여 3차원 재구성을 수행합니다. 소프트웨어에서 파일을 클릭하고 새 폴더를 선택하여 데이터 세트를 위한 새 폴더를 만들고 설명 이름을 할당하세요. 획득 탭에서 XY 포맷을 512 x 512, 해상도는 0.99 마이크로미터/픽셀로 설정하세요.

그다음 줌 팩터를 1로 설정하세요. 다음으로, 여기 파장을 488나노미터와 561나노미터로 설정합니다. 방출 창을 각각 500에서 550나노미터, 570에서 620나노미터로 설정하세요.

Z 시리즈와 3차원 영상 촬영의 경우, ND 획득 모드를 선택하세요. Z 스텝을 1마이크로미터로 설정하고 필요하면 조정하세요. 매개변수를 설정한 후, 라이브 모드를 선택하여 개별 및 병합된 형광 채널에서 치은부 부위를 시각화합니다.

그 다음 '지금 실행'을 눌러 이미지 수집을 시작하세요. 투과율을 측정하기 위해 FD40과 RD70의 형광 강도를 서로 다른 채널로 분리합니다. 배경 뺄셈 없이 Z축 슬라이스를 병합하세요.

그 후 ImageJ 소프트웨어를 사용해 형광 강도를 정량화하여 상피 장벽 투과성을 평가합니다. 파일을 클릭하고 ImageJ에서 상악 이미지를 열려면 열기를 선택하세요. 그 다음 이미지를 누르고 이미지 유형을 8비트 형식으로 변경해 분석하세요.

분석(analysis)을 클릭하고, 세트 측정값을 선택하세요. 그 다음 면적, 평균, 통합 밀도를 체크하고 확인을 클릭하세요. 그 다음 원하는 채널을 선택하고 이미지를 클릭한 후 조정을 선택한 후 임계값을 조정하세요.

검은 배경을 고려하기 위해 어두운 배경 옵션을 활성화하세요. 분석(analysis)을 클릭하고 세트 측정값을 선택하세요. 그다음 평균 회색값과 임계값 한도를 확인한 후 확인 버튼을 눌러 확인하세요.

자유손 선택 도구를 사용해 치은조직 쪽의 형광 신호 영역 윤곽을 수동으로 그려보세요. 분석 후 측정을 선택하여 형광 강도 값을 얻으려 하며, 여기서 통합 밀도는 형광 강도를 나타냅니다. 측정 결과를 스프레드시트에 복사해 계산과 그래프를 작성하세요.

대조군의 평균 형광 강도를 스프레드시트에서 계산하세요. 각 실험군의 형광 강도 값을 대조군 평균균으로 나누어 상대 형광 강도를 구합니다. 대조군에서는 두 형광 추적자가 주로 치은골 표면에 국한되어 있었습니다.

결찰군과 포르피로모나스 치은지발리스 치료군 모두에서 FD40과 RD70이 잇몸 상피로 유의미하게 유의미하게 유출되는 것이 관찰되었습니다. 준정량적 분석 결과, 결합군과 Porphyromonas gingivalis 처리 그룹에서 FD40과 RD70의 형광 강도가 유의하게 증가함을 보였습니다. 3D 영상 검사 결과, 연결군과 포르피로모나스 치은발리스 치료 그룹에서 치은혈관 주변의 트트레이서 형광 분포가 대조군보다 더 광범위하고 확산되어 있음을 확인하였습니다.

이 프로토콜은 마우스 치은세포 주변 장벽 투과성과 완전성을 정량화합니다. 이 프로토콜은 마이크로 CT와 결합하여 다중 모달 영상 분석을 수행할 수 있습니다. 추가 연구는 장벽 회복 약물과 구강 질환의 분자 기전을 탐구할 수 있습니다.