February 24th, 2026
이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.
저희 연구는 기존 현미경의 회절 한계를 극복하여 동적 세포 내 구조를 시각화하는 접근 가능한 초해상도 영상 기법 개발에 중점을 두고 있습니다. 초해상도 방법은 광독성, 복잡한 조작, 그리고 특수 준비 문제를 직면합니다. 이 프로토콜은 공초점 기반 다중화 검출을 통해 이러한 장벽을 낮춥니다.
우선, 현미경 메인 유닛, 레이저 발사 모듈, LED 광원, 제어 컴퓨터를 전원으로 가동하세요. 현미경 운영 소프트웨어를 실행하세요. 메인 인터페이스에서 GFP를 선택한 후 반사광을 끄세요.
획득 패널로 이동하세요. 대물렌즈 드롭다운 메뉴에서 적절한 대물렌즈를 선택하세요. 라이브 셀 영상 촬영 시 영상 촬영 45분에서 60분 전에 환경 챔버와 능동 초점 안정화 시스템을 활성화하세요.
시스템이 안정화된 후에는 챔버 센서로 안정성을 확인하세요. 대물렌즈 앞 렌즈에 기포가 생기지 않도록 침수 오일을 바르세요. 준비된 샘플을 현미경 스테이지에 올려놓으세요.
커버슬립이 침수 오일에 닿을 때까지 조심스럽게 들어 올립니다. 다음으로, 조달 소프트웨어를 엽니다. 획득 탭으로 가서 새 실험 생성 옵션을 선택하세요.
이제 사용한 형광체에 대한 영상 트랙을 추가하세요. 각 트랙마다 공초점 핀홀 직경을 1공기 단위로 설정하세요. 레이저 출력을 최적화하려면 첫 번째 채널을 선택하고 라이브 스캐닝 모드로 전환하세요.
초기 레이저 출력을 낮은 값으로 설정한 후, 검출기 이득을 선형 범위 내에서 중간 수준으로 설정하세요. 그 후 레이저 출력을 점차 증가시켜 실시간 이미지에서 목표 구조물이 배경 위로 명확히 보일 때까지 유지합니다. 소프트웨어의 나이퀴스트 샘플링 버튼을 사용해 픽셀 크기를 자동으로 계산하세요.
다음으로 픽셀 시간을 설정하세요. 이제 트랙 간 순차 스캔 모드를 선택하여 크로스토크를 최소화하세요. 스냅을 클릭하면 단일 이미지를 얻을 수 있습니다.
관련 메타데이터와 함께 이미지를 저장하세요. 광학 단면 전반에 걸쳐 일관된 설정을 위해 Z-스택을 정의하기 전에 모든 영상 매개변수가 단일 최적 초점면에 구성되어 있는지 확인하세요. 획득 탭을 열고 Z-스택 모드를 선택하세요.
빠른 속도의 라이브 스캔을 사용해 관심 있는 가장 아래 구조물에 초점을 맞추고, 그 다음 '마지막 또는 하단 설정'을 클릭해 관심 부피를 정의하세요. 관심 있는 가장 상단 구조로 초점을 조정한 후 Set First 또는 Top을 클릭하세요. 소프트웨어는 전체 깊이를 표시합니다.
Z-스택 크기는 나이퀴스트 표본 추출 기준을 충족하도록 설정됩니다. 최적 버튼을 사용해 자동으로 계산하세요. 각 채널의 영상 매개변수를 설정한 후, 단일 2차원 영상에 비해 약한 신호에 대해 레이저 출력이나 이득을 약간 높입니다.
전체 이미지 스택을 수집하기 위해 획득을 시작하세요. 시각화를 위해서는 현미경의 기본 처리 모듈을 사용하세요. 최대 강도 투영을 생성하여 모든 초점 신호를 단일 2차원 이미지로 볼 수 있습니다.
그 후 소프트웨어에 내장된 알고리즘을 사용해 3차원 표현을 생성하는 볼륨 렌더링을 수행합니다. 밝기, 불투명도, 조명을 필요에 따라 조절하세요. 그 후 직교 XZ 및 YZ 단면면을 생성하여 축 방향 범위와 등록을 검사합니다.
고정된 COS-7 세포의 다색 형광 영상을 통해 핵, 미토콘드리아, 미세소관이 명확하게 표지되어 중복이 최소화되어 효과적인 순차 스캐닝과 최적화된 검출을 확인하였습니다. 최대 강도 투영은 모든 광학 단면에 걸친 신호를 통합하여 형광 표지된 구조의 공간적 분포를 강조합니다. 3차원 재구성은 샘플 아키텍처에 대한 깊이 인식 시각을 제공합니다.
EGFP 태그 미토콘드리아가 있는 생체 3B 간염 세포의 타임랩스 영상을 여러 모드에서 비교합니다. 시간대에 걸친 공초점 프레임은 명확한 구조를 보여주지만 점진적인 신호 손실이 나타납니다. 표준 초해상도 또는 SR 프레임은 더 높은 해상도를 보여주지만, 시간이 지남에 따라 사진 표백이 증가합니다.
빠른 초해상도 또는 SR-4Y 이미지는 늦은 시점에서도 안정적인 형광을 유지합니다. 100개 시점에 걸친 평균 EGFP 형광 강도 그래프는 SR-4Y 모드가 가장 안정적인 신호를 유지했음을 보여줍니다. 고정된 COS-7 셀에서의 영상 성능은 모드별로 비교되었으며, 초해상도 모드가 공초점보다 더 선명한 구조적 디테일을 제공했다.
100나노미터 형광 구슬을 이용한 점 확산 함수를 측정한 결과, Airyscan SR과 후속 조인트 디컨볼루션이 Airyscan SR만을 사용할 때보다 측면 및 축 해상도 모두를 향상시켰습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 약 120나노미터 해상도로 고정 및 생체 세포 모두에서 소기관 형태학, 세포골격 역학, 분자 공존 위치를 연구할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 고려사항은 고품질 커버 글라스와 최적화된 염색을 사용하여 초해상도 처리를 위한 신호 무결성을 보장하기 위한 세심한 샘플 준비입니다.
이 절차를 거쳐 연구자들은 ImageJ와 같은 전용 소프트웨어를 사용해 신호 대 잡음비나 공동위치 측정과 같은 정량적 이미지 분석을 수행할 수 있습니다.
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이 프로토콜은 다중화된 어레이 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용한 고급 이미징 애플리케이션 방법을 보여줍니다. 이를 통해 공초점에서 초고해상도(~120 nm)까지의 다중 모드 이미징이 가능해지며, 고해상도 세포 이미징을 보다 접근하기 쉽게 만듭니다.
Super-resolution confocal microscopy with multiplex detection enables nanoscale visualization of subcellular structures while reducing phototoxicity and operational complexity. This protocol supports high-content, quantitative imaging workflows essential for early discovery, target validation, and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The integrated platform and shared management model facilitate scalable, reproducible imaging across diverse research teams and portfolio projects.
This protocol bridges early discovery, screening, and translational research by providing a unified imaging workflow from confocal to super-resolution modes.